響應(yīng)面法優(yōu)化草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频奈⒉ㄌ崛」に?/h1>
2015-06-05 09:51:42石貝杰昂安娜李婉珍
食品工業(yè)科技 2015年3期 關(guān)鍵詞：影響實(shí)驗(yàn)
葛 飛,石貝杰,龔 倩,昂安娜,李婉珍,桂 琳
(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室,安徽蕪湖 241000)
響應(yīng)面法優(yōu)化草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频奈⒉ㄌ崛」に?/p>
葛 飛1,石貝杰1,龔 倩1,昂安娜1,李婉珍1,桂 琳2,*
(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室,安徽蕪湖 241000)
目的:利用響應(yīng)面分析法對(duì)微波輔助提取草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)乒に囘M(jìn)行研究。方法:在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取微波功率、提取時(shí)間、提取溫度和液料比為影響因素,以草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷蕿轫憫?yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果:草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频淖罴盐⒉ㄌ崛l件為微波功率720W、提取時(shí)間21min、提取溫度66℃和液料比36mL/g。在此條件下,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷蕿?.65%。結(jié)論:采用微波技術(shù)提取草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频墓に嚪€(wěn)定性好,提取率高。
響應(yīng)面法,草菇,菌絲體,微波提取
草菇(Volvariellavolvacea)又名美味苞腳菇、蘭花菇、中國(guó)菇等,在日本稱(chēng)為中華春占地、袋茸等,是一種名貴食用菌[1-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明,草菇具有抗氧化[4]、調(diào)節(jié)免疫[5-7]、抗腫瘤[8]等多種藥理活性,具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。
三萜(triterpenoids)是由30個(gè)碳原子組成的萜類(lèi)化合物,有的以游離形式存在,有的則與糖結(jié)合成苷的形式存在(三萜糖苷)[2]。三萜類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗生育、殺軟體動(dòng)物等生物活性[2,9]。
目前,草菇的加工利用還處于粗淺階段,急需發(fā)展深加工技術(shù)[10],對(duì)草菇菌絲體中三萜類(lèi)物質(zhì)提取工藝的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化的方法,對(duì)草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频奈⒉ㄌ崛」に囘M(jìn)行了研究,為草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體的深度利用及其相關(guān)保健食品的開(kāi)發(fā)提供參考資料。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 菌種VolvariellavolvaceaSG32 安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心保藏。
1.1.2 主要試劑 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海研域生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L,酵母膏10g/L,瓊脂20g/L,pH自然；液體搖瓶培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L,酵母膏10g/L,pH自然。
1.1.4 主要儀器設(shè)備 L5型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；MAS-Ⅱ微波提取裝置 上海市新儀微波化學(xué)科技有限公司；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；L550型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；FreeZone12冷凍干燥系統(tǒng) 美國(guó)LABCONCO公司；WK-600A高速粉碎機(jī) 青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 草菇液態(tài)搖瓶培養(yǎng) 采用1.1.3液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。在溫度為30℃,搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下閉光振蕩培養(yǎng)9d,5000r/min離心20min后,雙層紗布過(guò)濾獲得菌絲體,將獲取的菌絲體再經(jīng)冷凍干燥后,粉碎,備用。
1.2.2 微波輔助提取草菇菌絲體中總?cè)?準(zhǔn)確稱(chēng)取草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體5.000g加入一定體積的75%乙醇,用微波提取裝置輔助提取草菇菌絲體中總?cè)啤?/p>
1.2.3 草菇菌絲體中總?cè)茰y(cè)定 測(cè)定方法按參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品,齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得線(xiàn)性回歸方程:A=0.007m-0.0034(R2=0.998)。上式中,m為齊墩果酸質(zhì)量(μg),A為吸光度。
將1.2.2獲得的提取液經(jīng)適當(dāng)處理后,在550nm處測(cè)OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及測(cè)定OD值,計(jì)算草菇菌絲體中總?cè)坪俊?/p>
1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.2.4.1 微波功率對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇提取時(shí)間為15min、提取溫度60℃、液料比30mL/g,分別用300、400、500、600、700、800和900W的微波功率提取草菇菌絲體中總?cè)?考察微波功率對(duì)菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊憽?/p>
1.2.4.2 提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇微波功率為700W、提取溫度60℃、液料比30mL/g,分別提取5、10、15、20、25、30和35min,考察提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊憽?/p>
1.2.4.3 提取溫度對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇微波功率為700W、提取時(shí)間20min、液料比30mL/g,分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70和75℃條件下,進(jìn)行草菇菌絲體中總?cè)频奶崛?考察提取溫度對(duì)總?cè)铺崛⌒Ч挠绊憽?/p>
1.2.4.4 液料比對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇微波功率為700W、提取時(shí)間20min、提取溫度65℃,分別在液料比為10、20、25、30、35、40和45mL/g條件下,進(jìn)行草菇菌絲體中總?cè)频奶崛?考察液料比對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊憽?/p>
1.2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用BBD-RSM法設(shè)計(jì)優(yōu)化草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频奈⒉ㄌ崛」に噮?shù)。設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。
表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of experiment
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 微波功率對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖1可知,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷孰S微波功率的增加而增加；當(dāng)功率超過(guò)700W時(shí),繼續(xù)增大微波功率對(duì)提取率影響較小；本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)微波功率從700W增大到900W時(shí),菌絲體中總?cè)铺崛÷蕛H增加了0.02%。結(jié)合能源消耗因素考慮,選擇700W為較佳微波提取功率。
圖1 微波功率對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.1 Effects of microwave power on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.1.2 提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖2可知,提取時(shí)間超過(guò)20min后,隨著提取時(shí)間的增大,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷试黾雍苄?幾乎沒(méi)有變化,將時(shí)間從20min延長(zhǎng)到35min時(shí),提取率僅增加了0.02%。因此,選擇20min為較佳提取時(shí)間。
圖2 提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.2 Effects of treatment time on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.1.3 提取溫度對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖3可見(jiàn),在30～65℃范圍內(nèi)時(shí),隨溫度升高草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷手鸩教岣撸划?dāng)溫度高于65℃時(shí),提取率反而略有減小。因此,確定較佳提取溫度為65℃。
圖3 提取溫度對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.3 Effects of treatment temperature on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.1.4 液料比對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖4可知,在液料比小于35mL/g時(shí),隨料液比的增加,總?cè)铺崛÷试黾用黠@；在液料比大于35mL/g后,總?cè)铺崛÷试黾用黠@變緩；當(dāng)液料比從35mL/g增加到45mL/g時(shí),提取率僅增加了0.01%。從提取成本等因素考慮,確定較佳液料比為35mL/g。
圖4 液料比對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.4 Effects of liquid-to-material ratio on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析
以總?cè)铺崛÷蕿轫憫?yīng)值,用Design-Expert8.0.6.1軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可建立如下二次回歸方程:Y=1.64+0.052A+0.11B+0.057C+0.053D+0.01AB+0.04AC+0.085AD+0.065BC-0.11BD-0.045CD-0.18A2-0.26B2-0.21C2-0.17D2。對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。
由表3可知,回歸模型達(dá)到極顯著水平p<0.0001,而失擬項(xiàng)為0.0940,說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況吻合較好,誤差較小,可信度較高。由F值大小可知,實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛⌒Ч挠绊懘笮?B>C>D>A,即提取時(shí)間>提取溫度>料液比>微波功率。另外,AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)總?cè)频奶崛÷室灿酗@著影響。因此,實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系,二次項(xiàng)對(duì)三萜提取率也有很大影響。
表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken
表3 Box-Behnken Design響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis table of Box-Behnken
注:**代表p<0.01,極顯著；*代表p<0.05,顯著。2.3 響應(yīng)面分析
運(yùn)用Design-Expert8.0.6.1軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到微波功率、提取時(shí)間、提取溫度和液料比四個(gè)因素兩兩之間響應(yīng)面立體分析圖如圖5～圖10所示。
圖5 微波功率和提取時(shí)間交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.5 RSD figures for the effects of microwave power and treatment time on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖6 微波功率和提取溫度交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.6 RSD figures for the effects of microwave power and extracting temperature on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖7 微波功率和液料比交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.7 RSD figures for the effects of microwave power and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖8 提取時(shí)間和提取溫度交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.8 RSD figures for the effects of treatment time and extracting temperature on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖9 提取時(shí)間和液料比交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.9 RSD figures for the effects of treatment time and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖10 提取溫度和液料比交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.10 RSD figures for the effects of extracting temperature and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
等高線(xiàn)圖可以直觀(guān)地反映出兩變量交互作用的顯著程度,圓形表示兩因素交互作用不顯著、橢圓形表示兩因素交互作用顯著。由圖5～圖10可以看出,圖5中等高線(xiàn)接近圓形,說(shuō)明微波功率與提取時(shí)間兩個(gè)因素交互作用不顯著；圖6～圖10中的等高線(xiàn)均呈橢圓形,表明兩者交互作用顯著。
為確定各因素的最佳取值,用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化分析,得出回歸模型存在最大值點(diǎn),即最佳實(shí)驗(yàn)條件。經(jīng)分析,最佳提取條件為微波功率719.40W、提取時(shí)間21.04min、提取溫度65.88℃和液料比35.56mL/g。在此條件下,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷蕿?.668%。考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性,將各工藝參數(shù)修正為微波功率720W、提取時(shí)間21min、提取溫度66℃和液料比36mL/g。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,依據(jù)響應(yīng)面分析獲取修正后的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果菌絲體中總?cè)破骄崛÷蕿?.65%,與理論預(yù)測(cè)值接近,說(shuō)明獲取的最佳工藝參數(shù)是可行的、有效的。
3 結(jié)論
微波技術(shù)作為近年來(lái)發(fā)展的一門(mén)新技術(shù),它具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱速度快、控制方便、受熱體系溫度均勻、節(jié)約能量及不需要特殊分離步驟等優(yōu)點(diǎn)[12]。本文以75%乙醇為提取溶劑,利用微波輔
助乙醇的方法對(duì)草菇菌絲體中總?cè)七M(jìn)行提取,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以胞內(nèi)總?cè)频寐蕿轫憫?yīng)值,結(jié)合實(shí)驗(yàn)的可操作性,得出最佳微波萃取條件為微波功率720W、提取時(shí)間21min、提取溫度66℃和液料比36mL/g,該工藝條件下總?cè)铺崛÷士蛇_(dá)1.65%。該方法操作簡(jiǎn)便,穩(wěn)定性好,效率高,為有效提取草菇菌絲體中三萜類(lèi)物質(zhì)提供了一定的參考依據(jù)。
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Optimal microwave extraction conditions of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by response surface methodology
GE Fei1,SHI Bei-jie1,GONG Qian1,ANG An-na1,LI Wan-zhen1,GUI Lin2,*
(1. Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation Anhui Province,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China;2. Department of Microbiology and Immunology,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China)
Objective:Optimal microwave extraction conditions of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by response surface methodology was studied. Methods:Based on single factor experiments,microwave power,treatment time,extracting temperature and liquid-to-material ratio as main variables that influence extraction efficiency were identified. With the value of the total triterpenoids yield in the mycelia,the extraction conditions was optimized by response surface analysis method. Results:The optimal microwave extraction conditions was determined as follows:microwave power 720W,treatment time 21min,extrcting temperature 66℃ and liquid-to-material ratio 36mL/g. Under these conditions,the average extraction rate of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia reached 1.65%. Conclusions:Compared with other extraction methods,the method of extracting total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by microwave technique was efficient and stable.
response surface methodology；Volvariellavolvacea；mycelia；microwave extraction
2014-04-08
葛飛(1978-),男,博士,副教授,研究方向：微生物資源、天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用。
*通訊作者:桂琳(1980-),女,碩士，副教授,研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)。
安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目(2011SQRL079)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A049)。
TS201.3
B
1002-0306(2015)03-0270-05
10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.048
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葛 飛,石貝杰,龔 倩,昂安娜,李婉珍,桂 琳
(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室,安徽蕪湖 241000)
響應(yīng)面法優(yōu)化草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频奈⒉ㄌ崛」に?/p>
葛 飛1,石貝杰1,龔 倩1,昂安娜1,李婉珍1,桂 琳2,*
(1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000;2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室,安徽蕪湖 241000)
目的:利用響應(yīng)面分析法對(duì)微波輔助提取草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)乒に囘M(jìn)行研究。方法:在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取微波功率、提取時(shí)間、提取溫度和液料比為影響因素,以草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷蕿轫憫?yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果:草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频淖罴盐⒉ㄌ崛l件為微波功率720W、提取時(shí)間21min、提取溫度66℃和液料比36mL/g。在此條件下,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷蕿?.65%。結(jié)論:采用微波技術(shù)提取草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频墓に嚪€(wěn)定性好,提取率高。
響應(yīng)面法,草菇,菌絲體,微波提取
草菇(Volvariellavolvacea)又名美味苞腳菇、蘭花菇、中國(guó)菇等,在日本稱(chēng)為中華春占地、袋茸等,是一種名貴食用菌[1-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明,草菇具有抗氧化[4]、調(diào)節(jié)免疫[5-7]、抗腫瘤[8]等多種藥理活性,具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。
三萜(triterpenoids)是由30個(gè)碳原子組成的萜類(lèi)化合物,有的以游離形式存在,有的則與糖結(jié)合成苷的形式存在(三萜糖苷)[2]。三萜類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗生育、殺軟體動(dòng)物等生物活性[2,9]。
目前,草菇的加工利用還處于粗淺階段,急需發(fā)展深加工技術(shù)[10],對(duì)草菇菌絲體中三萜類(lèi)物質(zhì)提取工藝的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化的方法,對(duì)草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频奈⒉ㄌ崛」に囘M(jìn)行了研究,為草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體的深度利用及其相關(guān)保健食品的開(kāi)發(fā)提供參考資料。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 菌種VolvariellavolvaceaSG32 安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心保藏。
1.1.2 主要試劑 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海研域生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L,酵母膏10g/L,瓊脂20g/L,pH自然；液體搖瓶培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,葡萄糖40g/L,酵母膏10g/L,pH自然。
1.1.4 主要儀器設(shè)備 L5型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；MAS-Ⅱ微波提取裝置 上海市新儀微波化學(xué)科技有限公司；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；L550型臺(tái)式低速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；FreeZone12冷凍干燥系統(tǒng) 美國(guó)LABCONCO公司；WK-600A高速粉碎機(jī) 青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 草菇液態(tài)搖瓶培養(yǎng) 采用1.1.3液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。在溫度為30℃,搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下閉光振蕩培養(yǎng)9d,5000r/min離心20min后,雙層紗布過(guò)濾獲得菌絲體,將獲取的菌絲體再經(jīng)冷凍干燥后,粉碎,備用。
1.2.2 微波輔助提取草菇菌絲體中總?cè)?準(zhǔn)確稱(chēng)取草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體5.000g加入一定體積的75%乙醇,用微波提取裝置輔助提取草菇菌絲體中總?cè)啤?/p>
1.2.3 草菇菌絲體中總?cè)茰y(cè)定 測(cè)定方法按參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品,齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得線(xiàn)性回歸方程:A=0.007m-0.0034(R2=0.998)。上式中,m為齊墩果酸質(zhì)量(μg),A為吸光度。
將1.2.2獲得的提取液經(jīng)適當(dāng)處理后,在550nm處測(cè)OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及測(cè)定OD值,計(jì)算草菇菌絲體中總?cè)坪俊?/p>
1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.2.4.1 微波功率對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇提取時(shí)間為15min、提取溫度60℃、液料比30mL/g,分別用300、400、500、600、700、800和900W的微波功率提取草菇菌絲體中總?cè)?考察微波功率對(duì)菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊憽?/p>
1.2.4.2 提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇微波功率為700W、提取溫度60℃、液料比30mL/g,分別提取5、10、15、20、25、30和35min,考察提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊憽?/p>
1.2.4.3 提取溫度對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇微波功率為700W、提取時(shí)間20min、液料比30mL/g,分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70和75℃條件下,進(jìn)行草菇菌絲體中總?cè)频奶崛?考察提取溫度對(duì)總?cè)铺崛⌒Ч挠绊憽?/p>
1.2.4.4 液料比對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?選擇微波功率為700W、提取時(shí)間20min、提取溫度65℃,分別在液料比為10、20、25、30、35、40和45mL/g條件下,進(jìn)行草菇菌絲體中總?cè)频奶崛?考察液料比對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊憽?/p>
1.2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用BBD-RSM法設(shè)計(jì)優(yōu)化草菇液態(tài)發(fā)酵菌絲體中總?cè)频奈⒉ㄌ崛」に噮?shù)。設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1。
表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of experiment
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 微波功率對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖1可知,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷孰S微波功率的增加而增加；當(dāng)功率超過(guò)700W時(shí),繼續(xù)增大微波功率對(duì)提取率影響較小；本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)微波功率從700W增大到900W時(shí),菌絲體中總?cè)铺崛÷蕛H增加了0.02%。結(jié)合能源消耗因素考慮,選擇700W為較佳微波提取功率。
圖1 微波功率對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.1 Effects of microwave power on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.1.2 提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖2可知,提取時(shí)間超過(guò)20min后,隨著提取時(shí)間的增大,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷试黾雍苄?幾乎沒(méi)有變化,將時(shí)間從20min延長(zhǎng)到35min時(shí),提取率僅增加了0.02%。因此,選擇20min為較佳提取時(shí)間。
圖2 提取時(shí)間對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.2 Effects of treatment time on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.1.3 提取溫度對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖3可見(jiàn),在30～65℃范圍內(nèi)時(shí),隨溫度升高草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷手鸩教岣撸划?dāng)溫度高于65℃時(shí),提取率反而略有減小。因此,確定較佳提取溫度為65℃。
圖3 提取溫度對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.3 Effects of treatment temperature on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.1.4 液料比對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷实挠绊?由圖4可知,在液料比小于35mL/g時(shí),隨料液比的增加,總?cè)铺崛÷试黾用黠@；在液料比大于35mL/g后,總?cè)铺崛÷试黾用黠@變緩；當(dāng)液料比從35mL/g增加到45mL/g時(shí),提取率僅增加了0.01%。從提取成本等因素考慮,確定較佳液料比為35mL/g。
圖4 液料比對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷实挠绊慒ig.4 Effects of liquid-to-material ratio on extraction rate of total triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析
以總?cè)铺崛÷蕿轫憫?yīng)值,用Design-Expert8.0.6.1軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可建立如下二次回歸方程:Y=1.64+0.052A+0.11B+0.057C+0.053D+0.01AB+0.04AC+0.085AD+0.065BC-0.11BD-0.045CD-0.18A2-0.26B2-0.21C2-0.17D2。對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。
由表3可知,回歸模型達(dá)到極顯著水平p<0.0001,而失擬項(xiàng)為0.0940,說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況吻合較好,誤差較小,可信度較高。由F值大小可知,實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)草菇菌絲體中總?cè)铺崛⌒Ч挠绊懘笮?B>C>D>A,即提取時(shí)間>提取溫度>料液比>微波功率。另外,AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)總?cè)频奶崛÷室灿酗@著影響。因此,實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系,二次項(xiàng)對(duì)三萜提取率也有很大影響。
表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken
表3 Box-Behnken Design響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis table of Box-Behnken
注:**代表p<0.01,極顯著；*代表p<0.05,顯著。2.3 響應(yīng)面分析
運(yùn)用Design-Expert8.0.6.1軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到微波功率、提取時(shí)間、提取溫度和液料比四個(gè)因素兩兩之間響應(yīng)面立體分析圖如圖5～圖10所示。
圖5 微波功率和提取時(shí)間交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.5 RSD figures for the effects of microwave power and treatment time on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖6 微波功率和提取溫度交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.6 RSD figures for the effects of microwave power and extracting temperature on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖7 微波功率和液料比交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.7 RSD figures for the effects of microwave power and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖8 提取時(shí)間和提取溫度交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.8 RSD figures for the effects of treatment time and extracting temperature on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖9 提取時(shí)間和液料比交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.9 RSD figures for the effects of treatment time and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
圖10 提取溫度和液料比交互作用 對(duì)草菇菌絲體總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖Fig.10 RSD figures for the effects of extracting temperature and liquid-to-material ratio on extraction rate of triterpenoid in the mycelia of Volvariella volvacea
等高線(xiàn)圖可以直觀(guān)地反映出兩變量交互作用的顯著程度,圓形表示兩因素交互作用不顯著、橢圓形表示兩因素交互作用顯著。由圖5～圖10可以看出,圖5中等高線(xiàn)接近圓形,說(shuō)明微波功率與提取時(shí)間兩個(gè)因素交互作用不顯著；圖6～圖10中的等高線(xiàn)均呈橢圓形,表明兩者交互作用顯著。
為確定各因素的最佳取值,用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化分析,得出回歸模型存在最大值點(diǎn),即最佳實(shí)驗(yàn)條件。經(jīng)分析,最佳提取條件為微波功率719.40W、提取時(shí)間21.04min、提取溫度65.88℃和液料比35.56mL/g。在此條件下,草菇菌絲體中總?cè)铺崛÷蕿?.668%。考慮實(shí)驗(yàn)的可操作性,將各工藝參數(shù)修正為微波功率720W、提取時(shí)間21min、提取溫度66℃和液料比36mL/g。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性,依據(jù)響應(yīng)面分析獲取修正后的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果菌絲體中總?cè)破骄崛÷蕿?.65%,與理論預(yù)測(cè)值接近,說(shuō)明獲取的最佳工藝參數(shù)是可行的、有效的。
3 結(jié)論
微波技術(shù)作為近年來(lái)發(fā)展的一門(mén)新技術(shù),它具有穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱速度快、控制方便、受熱體系溫度均勻、節(jié)約能量及不需要特殊分離步驟等優(yōu)點(diǎn)[12]。本文以75%乙醇為提取溶劑,利用微波輔
助乙醇的方法對(duì)草菇菌絲體中總?cè)七M(jìn)行提取,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以胞內(nèi)總?cè)频寐蕿轫憫?yīng)值,結(jié)合實(shí)驗(yàn)的可操作性,得出最佳微波萃取條件為微波功率720W、提取時(shí)間21min、提取溫度66℃和液料比36mL/g,該工藝條件下總?cè)铺崛÷士蛇_(dá)1.65%。該方法操作簡(jiǎn)便,穩(wěn)定性好,效率高,為有效提取草菇菌絲體中三萜類(lèi)物質(zhì)提供了一定的參考依據(jù)。
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Optimal microwave extraction conditions of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by response surface methodology
GE Fei1,SHI Bei-jie1,GONG Qian1,ANG An-na1,LI Wan-zhen1,GUI Lin2,*
(1. Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation Anhui Province,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China;2. Department of Microbiology and Immunology,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China)
Objective:Optimal microwave extraction conditions of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by response surface methodology was studied. Methods:Based on single factor experiments,microwave power,treatment time,extracting temperature and liquid-to-material ratio as main variables that influence extraction efficiency were identified. With the value of the total triterpenoids yield in the mycelia,the extraction conditions was optimized by response surface analysis method. Results:The optimal microwave extraction conditions was determined as follows:microwave power 720W,treatment time 21min,extrcting temperature 66℃ and liquid-to-material ratio 36mL/g. Under these conditions,the average extraction rate of total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia reached 1.65%. Conclusions:Compared with other extraction methods,the method of extracting total triterpenoids fromVolvariellavolvaceamycelia by microwave technique was efficient and stable.
response surface methodology；Volvariellavolvacea；mycelia；microwave extraction
2014-04-08
葛飛(1978-),男,博士,副教授,研究方向：微生物資源、天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用。
*通訊作者:桂琳(1980-),女,碩士，副教授,研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)。
安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目(2011SQRL079)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A049)。
TS201.3
B
1002-0306(2015)03-0270-05
10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.048
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