響應面法優化藍莓葉多糖提取工藝

李穎暢,王亞麗,齊鳳元,張 笑,李作偉

(1.渤海大學化學化工與食品安全學院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”,遼寧錦州 121013)

響應面法優化藍莓葉多糖提取工藝

李穎暢1，2，3,王亞麗1，2，3,齊鳳元1，2，3,張 笑1，2，3,李作偉1，2，3

(1.渤海大學化學化工與食品安全學院,遼寧錦州 121013;2.遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;3.遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質量安全控制工程技術研究中心”,遼寧錦州 121013)

植物多糖是一種重要的生物活性物質,具有抗氧化、增強機體免疫功能和防治心血管疾病等作用。對藍莓葉多糖進行有效的開發利用,對提高藍莓葉的經濟價值具有重要意義。本文采用熱水浸提,醇沉的方法提取藍莓葉多糖,通過響應面法優化藍莓葉多糖提取工藝,硫酸-苯酚法測定多糖含量。實驗結果表明:提取時間為4.2h,提取溫度為85℃,料液比為1∶35(g/mL),5倍體積乙醇醇沉6h時,提取藍莓葉多糖的能力最佳。在此工藝條件下得到藍莓葉多糖的提取量為29.2mg/g。本實驗從藍莓葉中提取多糖,為今后進一步研究與開發藍莓葉資源提供了理論依據。

藍莓葉多糖,提取,醇沉,響應面法

藍莓,又稱烏飯樹、越桔、藍漿果等,屬杜鵑花科越桔屬植物[1]。我國藍莓葉資源豐富,分布于全國各地。藍莓葉,一般為橢圓形至長圓形,全綠,藥食兩用。藍莓葉中含有多糖類、多酚類化合物、氨基酸、脂肪酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、有機酸、維生素、礦質元素、甾醇和萜類等[2-3]。多糖是一類廣泛存在于植物體內的物質,近年來越來越多的植物多糖被用于藥物和功能食品上,植物多糖具有抗氧化、清除自由基、增強免疫力、抗腫瘤和抗病毒等生物活性[4-7]。目前對藍莓葉的研究大多集中在藍莓葉多酚的提取、生物活性等研究上[8-14],對藍莓葉多糖的研究還鮮有報道。本文主要從提取時間,提取溫度,料液比等方面探索了藍莓葉多糖提取的最佳工藝條件,并從醇沉時乙醇的加入量,醇沉時間方面探索了醇沉分離多糖的最佳提取工藝,為藍莓葉多糖的工業化生產提供理論依據和實驗基礎,也為進一步研究開發藍莓葉高附加值產品以及對藍莓葉資源的綜合開發利用提供科學思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓葉 采于沈陽農業科學發展研究院；葡萄糖(分析純) 天津市大茂化學試劑廠；硫酸(優級純),硫酸含量98% 錦州市古城化學試劑廠；苯酚(分析純) 天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇(分析純) 天津市天力化學試劑有限公司。

萬能高速粉碎機 歐凱萊芙(香港)實業公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SHZ-D(III)循環水真空泵 上海申光儀器儀表有限公司；TD5A-WS型臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；101B-2型電熱鼓風干燥箱 上海申光儀器儀表有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度儀(SHIMADZU) 島津儀器(蘇州)有限公司；FA2004型電子分析天平 上海恒平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖含量的測定 多糖含量的測定采用硫酸苯酚比色法[15]。多糖濃度根據回歸曲線方程計算,多糖提取量根據以下公式計算。

多糖提取量(mg/g)=C×V×n/(1000m)

其中：C是藍莓葉多糖濃度(μg/mL),V是提取樣品體積(mL),n是稀釋倍數,m藍莓葉多糖的質量(g)。

1.2.2 藍莓葉多糖提取條件的單因素實驗

1.2.2.1 提取時間的確定 稱取藍莓葉干燥粉末2g,在料液比為1∶40(g/mL),提取溫度80℃,醇沉時加入乙醇的倍數為4倍,醇沉時間為靜置過夜的條件下,考察提取時間分別為1、2、3、4、5h對藍莓葉多糖提取量的影響。

1.2.2.2 提取溫度的確定 稱取藍莓葉干燥粉末2g,在料液比為1∶40(g/mL),提取時間4h,醇沉時加入乙醇的倍數為4倍,醇沉時間為靜置過夜的條件下,考察溫度分別為60、70、80、90、100℃對藍莓葉多糖提取量的影響。

1.2.2.3 料液比的確定 稱取藍莓葉干燥粉末2g,在提取時間4h,提取溫度80℃,醇沉時加入乙醇的倍數為4倍,醇沉時間為靜置過夜條件下,考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)對藍莓葉多糖提取量的影響。

1.2.3 藍莓葉多糖提取條件的響應面實驗 根據上述單因素實驗的結果,對提取時間、提取溫度、料液比進行3因素3水平的響應面實驗,因素水平表見表1,以藍莓葉多糖提取量為指標,通過響應面實驗確定最佳提取條件。

1.2.4 藍莓葉多糖醇沉工藝

1.2.4.1 醇沉時間的確定 稱取藍莓葉干燥粉末2g,在料液比為1∶40(g/mL),熱水提取時間4h,提取溫度80℃,醇沉加乙醇倍數為4倍的條件下,醇沉時間分別為2、4、6、8、10h,離心去除上層清液得粗多糖,以藍莓葉多糖提取量為指標,確定最佳的醇沉時間。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4.2 醇沉時乙醇加入量的確定 稱取藍莓葉干燥粉末樣2g,在料液比為1∶40(g/mL),熱水提取時間4h,提取溫度80℃的條件下,向處理后的濃縮液中分別加入2、3、4、5、6倍量的無水乙醇,醇沉時間為靜置過夜,離心除去上層清液得到粗多糖,以藍莓葉多糖提取量為指標,確定最佳的乙醇加入量。

1.2.5 驗證實驗 稱取藍莓樣品2g,在提取時間4.2h、提取溫度85℃、料液比1∶35(g/mL)；5倍體積乙醇醇沉,醇沉時間為6h條件下,對藍莓葉多糖進行提取。

1.3 統計分析

采用Design-Expert 8.0.6 軟件進行3因素3水平Box-Behnken實驗設計和分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖作為標準品,以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線如圖1所示。由圖1得到回歸方程為y=0.0396x-0.0052(R2=0.9992),吸光度與葡萄糖濃度具有良好的線性關系,因此,可用于藍莓葉多糖含量測定。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 提取時間對藍莓葉多糖提取量的影響

從圖2可以看出,隨著提取時間的延長,多糖提取量升高,提取時間為1h時,多糖提取量只有16.6mg/g；在提取時間為4h,多糖提取量達到最大值,此時的多糖提取量已經達到23.3mg/g。當多糖提取時間為5h時,多糖提取量略有降低,但和提取時間為4h多糖提取量差異不顯著。隨著提取時間的延長,熱水致使藍莓葉原料中大分子多糖分解,導致多糖提取量略有下降。此外,提取時間過長還會使溶解的雜質增多,使多糖的純度降低,因此,藍莓葉多糖的最佳提取時間為4h。

圖2 提取時間對多糖提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide yield

2.3 提取溫度對藍莓葉多糖提取量的影響

從圖3可以看出,隨著提取溫度的提高,多糖提取量呈現先升高然后降低的趨勢。當提取溫度為60℃時,多糖提取量為10.5mg/g；當提取溫度為80℃時,多糖提取量達到23.9mg/g,此時藍莓葉多糖的提取量最高。超過80℃后,藍莓葉多糖的提取量略有下降,當提取溫度為100℃時,多糖提取量只為19.9mg/g。可能是因為較高溫度破壞了部分浸出的多糖,蛋白質等雜質的析出也將增加,從而使多糖的提取量略有降低。因此,藍莓葉多糖的最佳提取溫度為80℃。

圖3 提取溫度對多糖提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

2.4 料液比對藍莓葉多糖提取量的影響

從圖4可以看出,當料液比為1∶20(g/mL)時,多糖提取量為11.9mg/g,隨提取液用量的增加,多糖提取量逐漸增加。當料液比為1∶40(g/mL)時,多糖提取量最高,當再增大提取液的用量時,多糖提取率逐漸下降,當料液比為1∶60(g/mL)時,多糖提取量只為19.1mg/g。這是因為當溶劑體積過少時,不利于多糖的徹底溶解。當溶劑用量越多,隨之擴散到溶劑里的多糖就越多,并且會使其他雜質同時溶出,從而影響藍莓葉多糖的溶出。所以,從提取效率和減少溶劑回收難度等角度考慮,提取藍莓葉多糖的最佳料液比為1∶40(g/mL)。

圖4 料液比對多糖提取量的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on polysaccharide yield

2.5 響應面法優化藍莓葉多糖提取工藝

2.5.1 藍莓葉多糖提取工藝參數的優化 綜合單因素實驗結果,應用Design-Expert 8.0.6軟件,采用Box-Behnken Design 建立數學模型,以提取時間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)為自變量,以多糖提取量為因變量共設立了15個處理組。因素編碼及水平見表2,由Box-Behnken Design設計方案所得的實驗結果見表3。運用Design-Expert 8.0.6對響應值進行回歸分析,經回歸擬和后得到回歸方程:

Y=24.30+1.04X1+0.64X2+0.20X3-0.42X1X2-0.15X1X3-0.80X2X3-0.087X12+1.66X22+0.89X32。對回歸方程系數進行顯著性檢驗,從表3可以看出,一次項提取時間X1、提取溫度X2對藍莓葉多糖的提取量有顯著影響；二次項中的交互作用項提取溫度與料液比X2X3、平方項提取溫度X22、料液比X32對藍莓葉多糖提取量的影響顯著；其它對藍莓葉多糖提取量的影響不顯著。從F值可以看出,對于該模型來說,而對多糖提取量的影響趨勢為X1>X2>X3,即提取時間的影響最大,料液比的影響最小。

表2 Box-Behnken實驗結果Table 2 The results of Box-Behnken

表3 二次回歸模型的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for each term of developed quadratic regression model

注:*.差異顯著(p<0.05)。2.5.2 響應面分析和優化 響應面圖是響應值對各因素所構成的三維空間的曲面圖,圖5～圖7為提取時間(X1)、提取溫度(X2)、料液比(X3)在其中一個固定時,另外兩個因素對藍莓葉多糖含量的交互影響曲面圖。比較響應面優化圖5可以看出,相對提取溫度,提取時間(X1)對藍莓葉多糖含量的影響最為顯著,表現為曲線較陡,等高線密集；提取溫度次之,表現為曲線較為平滑；從圖6可以看出,相對料液比,提取時間對藍莓葉多糖提取量影響顯著,等高線密集,料液比對藍莓葉多糖提取量影響不顯著,等高線稀疏。從圖7可以看出,提取溫度對藍莓葉多糖提取量影響顯著,料液比的影響小,曲線平緩,等高線稀疏。選擇合適的提取溫度、料液比以及提取時間,可獲得較高的多糖提取量。對多糖提取量影響的3個因素中,從大到小依次為:提取時間(X1)>提取溫度(X2)>料液比(X3)。

圖5 提取時間和提取溫度對多糖的響應曲面圖Fig.5 Extraction time and extraction temperature on the polysaccharide of response surface diagram

圖6 提取時間和料液比對多糖的響應曲面圖Fig.6 Extraction time and solid-liquid ratio on the polysaccharide of response surface diagram

圖7 提取溫度和料液比對多糖的響應曲面圖Fig.7 Extraction temperature and liquid materials on the polysaccharide of response surface diagram

從上述回歸模型中求得最佳提取條件為提取時間4.2h、提取溫度85℃、料液比1∶35(g/mL),藍莓葉多糖提取量的理論值為28.3mg/g。由于以上最佳條件未包括在響應面優化的15組實驗中,需進一步進行實驗驗證。驗證實驗結果表明,在最佳提取條件下,藍莓葉多糖的提取量為27.9mg/g,與預測值相差不大,說明該方程與實際情況擬合很好,充分驗證了所建模型的正確性,說明響應面法適用于藍莓葉多糖物質提取工藝進行回歸分析和參數優化。

2.6 醇沉工藝條件的確定

2.6.1 醇沉時乙醇加入量的確定 從圖8可以看出,當乙醇的加入量為2倍體積時,多糖提取量為18.6mg/g,隨著乙醇加入倍數的增加,藍莓葉多糖提取量提高；當乙醇的加入量為5倍體積時,多糖提取量為25.1mg/g,多糖提取量達到最高,之后又下降。說明一定倍數的乙醇能夠使多糖的溶解度降低,有利于多糖的沉淀；高濃度醇會導致一些雜質的沉淀和多糖的溶出,致使沉淀物中多糖純度下降。因此選擇乙醇加入量為5倍體積。

圖8 醇沉倍數對多糖提取量的影響Fig.8 Effect of the ethanol folds on polysaccharides yield

2.6.2 醇沉時間的確定 從圖9可以看出,當醇沉時間為2h時,多糖提取量為19.3mg/g。隨著醇沉時間的延長,多糖充分沉淀,多糖提取量呈上升的趨勢,當醇沉時間為6h時,多糖提取量為26.6mg/g,但再經過一段時間,提取量反而下降,當醇沉時間為10h時,多糖提取量降為23.7mg/g。這可能是因為醇沉時間過長,致使沉淀出的多糖分解成單糖或其他物質,使測得到的多糖的有效成分降低,從而致使吸光度下降。所以,選擇醇沉時間為6h。

圖9 醇沉時間對多糖提取率的影響Fig.9 The effect of the ethanol-precipitation time on polysaccharides yield

2.7 驗證實驗

根據回歸方程為y=0.0396x-0.0052(R2=0.9992)和計算公式多糖提取量(mg/g)=C×V×n/(1000m),得出藍莓葉提取量為28.8、29.7、29.1mg/g,平均值為29.2mg/g。

3 結論

3.1 應用Design-Expert 8.0.6軟件,采用Box-Behnken Design建立了提取時間X1、提取溫度X2和料液比X3與藍莓葉多糖含量之間數學模型,

Y=24.30+1.04X1+0.64X2+0.20X3-0.42X1X2-0.15X1X3-0.80X2X3-0.087X12+1.66X22+0.89X32,回歸分析表明,相關系數R2=0.9405,p<0.01,表明擬合程度好,有實際應用意義；通過模型系數顯著性檢驗,各因素對結果的影響排序為:提取時間>提取溫度>料液比。

3.2 利用模型的響應面對影響藍莓葉多糖含量的關鍵因子及其相互作用進行探討,優化出藍莓葉多糖提取工藝的最佳條件為:提取時間4.2h、提取溫度85℃、料液比1∶35(g/mL)。藍莓葉多糖含量的預測值為28.3mg/g,驗證值為27.9mg/g。

3.3 藍莓葉多糖提取的優化醇沉工藝條件為5倍體積乙醇醇沉,醇沉時間為6h。

3.4 在優化后的提取條件和醇沉條件下藍莓葉多糖的提取量為29.2.mg/g。

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Optimization of extraction process of polysaccharides fromBlueberry leaves by response surface methodology

LI Ying-chang1，2，3,WANG Ya-li1，2，3,QI Feng-yuan1，2，3,ZHANG Xiao1，2，3,LI Zuo-wei1，2，3

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China;2.Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;3.Engineering and Technology Research Centerof Food Preservation,Processing and Safety Control of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

Polysaccharide is a kind of important biological active substance. Therefore,it is significant to effectively develop and utilize the polysaccharide from blueberry leaves and improve the economic and social benefits of blueberry leaves. In this paper,polysaccharide was extracted by the method of hot water immersed extraction and ethanol precipitation. Extraction process of water-soluble polysaccharides from blueberry leaves was optimized by response surface methodology. The content of polysaccharide was determined by sulfuric acid to phenol method. The results showed that the extraction time was 4.2h,extraction temperature was 85℃ and the ratio of material to liquid was 1∶35(g/mL). Polysaccharide was precipitated with 5 folds volume of ethanol for 6h. The proportion of the extraction of polysaccharide from blueberry leaves under this industrial process conditions was 29.2mg/g.

polysaccharide from blueberry leaves；extraction；ethanol precipitation；Box-Behnken design

2014-06-13

李穎暢(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：農、水產品貯藏加工與質量安全控制。

國家自然基金(31201308)。

TS254.4

B

1002-0306(2015)03-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.039