柚提取物含量測定及其抗氧化、抑菌活性研究

張 芳,姜媛媛,楊 洋,張 利

(四川農業大學生命科學與理學院,四川雅安 625014)

柚提取物含量測定及其抗氧化、抑菌活性研究

張 芳,姜媛媛,楊 洋,張 利*

(四川農業大學生命科學與理學院,四川雅安 625014)

采用水蒸氣蒸餾法、超聲波輔助溶劑萃取法以及酸提醇沉法分別提取柚葉、柚皮、柚肉、柚籽中精油、總黃酮和果膠,采用氣相色譜-質譜(GC-MS)、NaNO2-Al(NO3)3法和咔唑-硫酸法分別對精油成分和總黃酮、果膠含量進行分析。通過精油、總黃酮和果膠的總還原力及清除1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)能力的測定實驗評價其抗氧化活性,通過濾紙片擴散法評價其抑菌活性。結果表明:柚皮中精油和總黃酮含量最高；柚肉中果膠含量最高；柚皮精油共鑒定出25種化合物,其主要成分為D-檸檬烯(77.96%),β-月桂烯(12.40%)和β-蒎烯(2.14%)；柚三種活性成分(精油,總黃酮和果膠)均具有較強的還原力,對DPPH·的IC50(清除率達到50%時的濃度)分別為1.53%、0.07%和0.21%,表現出較強的抗氧化活性；對3種受試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌)均有抑制活性,且隨著物質濃度的增加,對受試菌的抑菌效果逐漸增強。該研究結果為柚資源的合理開發和回收再利用以及生物殺菌劑、天然食品抗氧化劑和防腐劑的開發提供了理論依據。

柚,精油,總黃酮,果膠,抗氧化活性,抑菌活性

柚(Citrusmaxima)為蕓香科常綠果樹,在我國廣東、四川等地均有栽培[1]。柚皮可提取精油、果膠、柚皮甙和新橙皮甙等[2]。其中,柚皮香精油是飲料、啤酒、糖果的矯味劑和賦香劑；柚皮甙、蘆丁等黃酮類化合物具有抗氧化活性作用,可以降低血液黏稠度,預防腦血管疾病。柚籽中也存在相當數量的黃酮類化合物,在其甘油提取物中黃酮類化合物含量高達6700mg/kg[3]。已有研究結果表明,葡萄柚果皮內含有葡萄柚果膠,且果膠有明顯降低血漿總膽固醇和低密度脂蛋白的作用[4]。然而在實際生產中大量的柚葉、柚皮(約占柚質量的30%)和柚籽并沒有得到充分利用,造成嚴重的資源浪費和環境污染。本實驗以雅安地區的柚為研究材料,分別對柚葉、柚皮、柚肉和柚籽中的精油、總黃酮和果膠進行提取和含量測定,并研究其抗氧化和抑菌活性,旨在為柚的合理開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑麻柚 購于雅安市；無水硫酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、蘆丁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鹽酸、咔唑、硫酸均為分析純；磷酸鹽緩沖液(PBS)、D-半乳糖醛酸、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)(生化試劑) 美國Sigma公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellai) 來源于四川農業大學生命科學與理學院。實驗用水均為超純水。

UV-3200PC紫外/可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；HP6890GC/5973MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國惠普公司；R200D電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；80-1電動離心機 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；KQ-3200B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；KQ-300GDV恒溫數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DZ-2BC真空干燥箱 北京中興偉業儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；HH.S11-Ni6電熱恒溫水浴鍋 北京長安永創科學儀器有限公司；ZDHW調溫電熱套 北京中興偉業儀器有限公司；LDZX-40SAI立體式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；實驗室專用超純水機(Water Purifier) 四川沃特爾科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 活性成分的提取 精油的提取:稱取500g粉碎后的材料,置于燒瓶中,加水浸泡2h后進行水蒸氣蒸餾提取。所得揮發油用無水硫酸鈉干燥,-20℃黑暗保存備用[5-6]。

總黃酮的提取:稱取5g粉碎后的材料,按固液比1∶16(w/v)加入70%的乙醇,置于燒瓶中,于240W,40℃超聲提取30min,提取液于35℃旋轉蒸發,定容至10mL,備用[7]。

果膠的提取:稱取5g粉碎后的材料,按固液比1∶20(w/v)加入超純水,置于燒杯中,并用鹽酸調節pH至2,95℃攪拌100min,旋轉蒸發至原體積的1/3后加入2倍體積的無水乙醇,4℃下靜止一夜,45℃真空冷凍干燥,備用[8-9]。

1.2.2 活性成分含量的測定

1.2.2.1 精油化學成份的GC-MS分析 氣相色譜條件:色譜柱HP-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)彈性石英毛細管柱。升溫程序:初始溫度50℃,以5℃/min升至250℃,保持45min；汽化溫度325℃；進樣量0.5μL；載氣(He)流速1mL/min；分流流量20mL/min；分流比20∶1；溶劑延遲5min。質譜條件:電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230℃；電子能量70eV；掃描范圍40～550m/z。采用Wiley譜庫和NIST譜庫進行檢索,以面積歸一法計算相對含量。

1.2.2.2 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定方法參照文獻[10-11]并稍做修改。配制不同濃度的蘆丁標準液,分別取1mL不同濃度的蘆丁標準液于試管中,向試管中分別加入0.5mL 5%亞硝酸鈉溶液,震蕩混勻,放置6min,加入0.5mL 10%硝酸鋁溶液,搖勻后放置6min,加入4mL 4%氫氧化鈉溶液,搖勻,靜置20min。以70%乙醇代替樣品作為空白對照。于510nm波長處測定吸光度,以質量濃度為橫坐標(x),吸光度為縱坐標(y)繪制標準曲線。

按照上述方法測定樣品吸光度,每個樣品濃度梯度平行實驗3次,取其平均值。通過標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

1.2.2.3 果膠含量的測定 果膠含量的測定方法參照文獻[12]并稍做修改。配制不同濃度的D-半乳糖醛酸標準液,分別取1mL不同濃度的稀釋液于試管中,加5mL濃硫酸,立即搖勻,85℃水浴8min,取出冷卻,再分別加入0.5mL 0.15%咔唑無水乙醇溶液,85℃水浴8min,室溫暗處放置30min。以超純水代替樣品作為空白對照,于530nm波長處測定吸光度,以質量濃度為橫坐標(x),吸光度為縱坐標(y)繪制標準曲線。

按照上述方法測定樣品吸光度,每個樣品濃度梯度平行實驗3次,取其平均值。通過標準曲線回歸方程計算樣品中果膠含量。

1.2.3 抗氧化活性研究

1.2.3.1 還原力的測定 參照文獻[13-14],對樣品的還原力進行測定。分別取2.5mL不同濃度樣品溶液,加入2.5mL PBS(0.2mol/L,pH為6.60),2.5mL 1.0%的鐵氰化鉀溶液,混合均勻后將該體系置于50℃水浴20min,加入10%三氯乙酸溶液2.5mL,混勻后3000r/min離心10min,移取上清液5mL,加入4mL超純水,1mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻。用超純水代替樣品溶液作為空白對照,10min后于700nm處測定吸光度。每個樣品濃度梯度平行實驗3次,取其平均值。

1.2.3.2 DPPH·清除能力的測定 參照文獻[15],測定樣品對DPPH·清除能力。分別取2mL不同濃度樣品溶液,加入2mL 0.1mmol/L的DPPH·溶液,混勻后室溫避光反應30min后,517nm波長處測吸光度。用VC代替樣品溶液作為對照,超純水代替DPPH·溶液為樣品空白。每個樣品濃度梯度平行實驗3次,取其平均值。

DPPH·清除活性(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中：A0:2mL DPPH+2mL無水乙醇的吸光度；A1:2mL DPPH+2mL樣品的吸光度；A2:2mL無水乙醇+2mL樣品的吸光度。

1.2.4 抑菌活性研究

1.2.4.1 培養基的制備 配制牛肉膏蛋白胨培養基,備用[16]。

1.2.4.2 菌懸液的制備 將各菌種活化,制成菌懸液。采用平板計數法調至濃度為含菌體106～107CFU/mL的菌懸液,備用[17]。

1.2.4.3 濾紙片擴散法測定抑菌圈 配制一定濃度的受試物溶液,參照文獻[18]選取抑菌圈比較明顯的平板測定抑菌圈直徑,每種菌設置3個平行,結果取其平均值。

1.3 數據處理

數據統計分析采用SPSS20.0軟件進行,繪圖采用Origin 8.0軟件進行。數值表示為平均值±SD。

2 結果與分析

2.1 柚不同部位活性成分的含量測定

總黃酮含量測定標準曲線線性回歸方程為:y=1.8027x-0.0008,相關系數R2為0.9998,式中:y為吸光度,x為蘆丁質量濃度(mg/mL)。果膠含量測定標準曲線線性回歸方程為:y=0.0066x+0.1288,相關系數R2為0.9996,式中:y為吸光度,x為D-半乳糖醛酸質量濃度(mg/mL)。

柚不同部位精油、總黃酮和果膠含量測定結果如表1所示。由表1可知,柚皮中精油和總黃酮含量最高,分別為0.69%±0.10%和0.61%±0.04%。但雅安地區的桑麻柚皮中總黃酮的含量仍低于楊轉琴等[19]研究的沙田柚皮中總黃酮含量。柚葉、柚籽和柚肉未檢出精油。柚肉中果膠含量最高,為3.46%±0.28%,是柚皮中果膠含量的1.10倍,且柚肉和柚皮中果膠含量具有顯著性差異(p<0.05)。因此,可根據需要對不同部位活性物質的含量進行提取,使之得到充分合理的利用,避免丟棄造成的資源浪費和環境污染。

表1 柚不同部位精油、總黃酮和果膠含量Table 1 The contents of essential oils,flavonoids and pectin in different parts of pomelo

注:“-”表示精油含量未檢出；同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.2 精油化學成分的GC-MS分析

利用GC-MS聯用儀對柚皮精油進行成分分析,共鑒定出25種化合物,占總組分的99.24%,各化合物的保留時間、相對百分含量見表2。

在已鑒定的柚皮精油成分中,烯類成分9個,占94.60%；醇類成分9個,占3.12%；醛類成分4個,占1.1%；其他成分3個。主要成分為D-檸檬烯(77.96%),β-月桂烯(12.40%),β-蒎烯(2.14%),芳樟醇(0.77%),順-α,α,5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇(0.58%),p-薄荷-1-烯-8-醇(0.47%)。D-檸檬烯是一種單萜類化合物,是食品、飲料等的調香劑,也是醫藥、化妝品的重要原料,在家庭日化、工業洗滌劑、油漆涂料、紡織印染等行業中有廣泛的用途[20]。β-月桂烯可用于古龍香水和消除劑[21]；β-蒎烯用作各種萜烯類合成香料的起始原料[22]。因此,柚皮精油可用于食品、藥品以及化妝品行業中,從而使廢棄的柚皮可以得到充分合理的應用。

2.3 柚活性成分的抗氧化活性研究

根據活性物質含量比較結果,以柚皮為原材料提取精油和總黃酮,以柚肉為原材料提取果膠,分別對柚精油、總黃酮和果膠進行抗氧化和抑菌活性研究。

柚皮精油、總黃酮和柚肉果膠的抗氧化活性研究結果分別如圖1～圖3所示。研究結果表明,柚皮精油、總黃酮和柚肉果膠均表現出較強的抗氧化活性,對DPPH·的IC50值分別為1.53%,0.07%和0.21%。

圖1 精油還原力及對DPPH·的清除能力Fig.1 Reducing power and scavenging effects on DPPH· of essential oil

圖 2 總黃酮還原力及對DPPH·的清除能力Fig.2 Reducing power and scavenging effects on DPPH· of flavonoids

在1%～8%濃度范圍內,精油還原力與精油濃度呈現明顯的量效關系。當精油濃度為8%時,吸光度為0.996,表現出較強的還原力。在1%～8%范圍內,精油對DPPH·均有清除作用,且在1%～4%范圍內,隨著精油濃度的增加,對DPPH·的清除能力逐漸增強；4%～8%范圍內,隨精油濃度的增加對DPPH·的清除能力趨于平緩。當濃度為8%時,精油對DPPH·的清除率達到94.68%。

表2 柚皮精油的化學成分分析結果Table 2 Analysis results of chemical composition of pomelo peel essential oil

圖3 果膠還原力及對DPPH·的清除能力Fig.3 Reducing power and scavenging effects on DPPH·of pectin

圖4 VC對DPPH·的清除能力Fig.4 Scavenging effects on DPPH·of VC

在0.01%～0.22%濃度范圍內,總黃酮還原力與總黃酮濃度呈現明顯的量效關系。當總黃酮濃度為0.22%時,吸光度為0.969,表現出較強的還原力。在0.01%～0.22%濃度范圍內,總黃酮對DPPH·均有清除作用,且在0.01%～0.17%范圍內,隨濃度的增加對DPPH·的清除能力逐漸增強；而在0.17%～0.22%濃度范圍內,隨濃度的增加總黃酮對DPPH·的清除能力趨于平緩。當濃度為8%時,總黃酮對DPPH·的清除率達到91.84%。

在0.05%～1%濃度范圍內,果膠還原力與果膠濃度呈現明顯的量效關系。當果膠濃度為1%時,吸光度為0.845,表現出較強的還原力。在0.05%～1%濃度范圍內,果膠對DPPH·均有清除作用。在0.05%～0.8%范圍內,隨著濃度的增加,果膠對DPPH·的清除能力逐漸增強,隨后呈現降低的變化趨勢。當濃度為0.8%時,果膠對DPPH·的清除率達到84.97%。

表3 精油的抑菌活性Table 3 Inhibition effects of essential oils on three kinds of bacteria

注:同行不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。表3～表5同。

表4 總黃酮的抑菌活性Table 4 Inhibition effects of flavonoids on three kinds of bacteria

表5 果膠的抑菌活性Table 5 Inhibition effects of pectin on three kinds of bacteria

2.4 柚活性成分的抑菌活性研究

柚皮精油、總黃酮和柚肉果膠的抑菌活性研究結果分別如表3～表5所示。抑菌圈實驗結果的判定標準是:抑菌圈直徑大于20mm為極度敏感,15～20mm為高度敏感,10～15mm時為中度敏感,7～9mm時為低度敏感,無抑菌圈者為不敏感[23]。研究結果表明,精油、總黃酮和果膠對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌都有較強的抑菌活性,且濃度越高抑菌作用越強。

純精油和1.69%的總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于20mm,抑菌效果表現為極度敏感。當精油濃度為25.00%和50.00%時,對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果均表現出極顯著差異(p<0.01),抑菌圈直徑均在10～15mm之間,抑菌效果均表現為中度敏感,而對金黃色葡萄球菌的抑菌效果差異顯著(p<0.05),抑菌圈直徑分別為(17.54±0.97)mm和(17.42±1.22)mm,抑菌效果表現為高度敏感。當總黃酮濃度為0.42%和0.84%時,對大腸桿菌的抑菌效果差異顯著(p<0.05),對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果差異極顯著(p<0.01)；對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑均在10～15mm之間,抑菌效果表現為中度敏感,而對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為(17.02±0.59)mm和(19.18±0.79)mm,抑菌效果表現為高度敏感。果膠濃度為2%和8%時,對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果均沒有表現出顯著差異(p>0.05),對金黃色葡萄球菌的抑菌效果表現出極顯著差異(p<0.01),當果膠濃度為8%時,對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為(11.61±2.12)mm和(10.06±1.63)mm,抑菌效果表現為中度敏感；而果膠濃度為2%時對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為(8.74±1.79)mm和(8.85±1.88)mm,抑菌效果表現為低度敏感；果膠在受試濃度范圍內對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均在10～15mm之間,抑菌效果表現為中度敏感。

3 結論

柚皮中精油和總黃酮含量最高,分別為0.69%±0.10%和0.61%±0.04%；柚肉中果膠含量最高,為3.46%±0.28%。同時,通過氣相色譜-質譜聯用技術分析柚皮精油的化學成分,共鑒定出25種化合物,占總組分的99.24%。主要成分為D-檸檬烯(77.96%),β-月桂烯(12.40%),β-蒎烯(2.14%),芳樟醇(0.77%),順-α,α,5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇(0.58%),p-薄荷-1-烯-8-醇(0.47%)等,其中多種成分為有機化工、食品、藥品以及化妝品等行業的重要原料。柚皮精油、總黃酮和柚肉果膠均具有較強的還原力,且對清除DPPH·的IC50值分別為1.53%、0.07%和0.21%,表現出較強的抗氧化活性。柚皮精油、總黃酮和柚肉果膠對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均具有較強的抑菌活性,且隨著濃度的增加,抑菌作用逐漸增強。

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Determination of contents,antioxidant andantibacterial activity of grapefruit extracts

ZHANG Fang,JIANG Yuan-yuan,YANG Yang,ZHANG Li*

(College of Biology and Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Extracted essential oils,flavonoids,and pectin from pomelo leaves,peel,grapefruit meat and seeds using the method of steam distillation,ultrasonic assisted solvent extraction and acid extraction and alcohol precipitation was studied. Essential oils was analyzed by using the method of gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Besides,the determination of total flavonoids and pectin used the method of NaNO2-Al(NO3)3and carbazole-sulfuric acid. Finally the antioxidant activity of essential oils,flavonoids and pectin was evaluated by using the method of reducing power and scavenging the capability of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH·). And the antimicrobial activity was evaluated by using the method of filter paper diffusion. The results showed that,the contents of essential oils and flavonoids were the highest in the pomelo peel. And the contents of pectin were the highest in the pomelo meat. There were 25 kinds of compounds detected in pomelo peel oil,mainly D-limonene(77.96%),beta myrcene(12.40%)and beta pinene(2.14%). Pomelo three active ingredients(essential oils,flavonoids and pectin)had strong reducing power,and the IC50of DPPH·(the concentration of clearance rate were reached to 50%)were 1.53%,0.07% and 0.21%,respectively. Those all showed the strong antioxidant activity. There was different effect on the antibacterial of the three bacteria(Escherichiacoli,StaphylococcusaureusandSalmonellai). And with the increasing of mass concentration,the bacteriostatic effects of bacteria were gradually increased.

pomelo;essential oil;flavonoids;pectin;antioxidant activity;antibacterial activity

2014-04-08

張芳(1990-),女,本科,研究方向:應用化學。

*通訊作者:張利(1969-),女,博士，教授,研究方向:植物化學與成分分析。

四川農業大學大學生創新性實驗計劃項目(121062636)；國家農業科技成果轉化資金項目(2012GB2F000385)；國家科技型中小企業技術創新基金項目(12C26215105863)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)03-0065-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.004