高效液相色譜法測定復方清肺飲顆粒中淫羊藿苷的含量研究

施元洪劉鎮峰李鎮波陳玉興

1.汕頭大學醫學院第一附屬醫院藥劑科，廣東汕頭515041；2.廣東省汕頭市皮膚性病防治院藥劑科，廣東汕頭515041；3.廣東省汕頭市濠江區河浦人民醫院藥劑科，廣東汕頭515098；4.廣東省中醫研究所中藥室，廣州515000

高效液相色譜法測定復方清肺飲顆粒中淫羊藿苷的含量研究

施元洪1劉鎮峰2李鎮波3陳玉興4

1.汕頭大學醫學院第一附屬醫院藥劑科，廣東汕頭515041；2.廣東省汕頭市皮膚性病防治院藥劑科，廣東汕頭515041；3.廣東省汕頭市濠江區河浦人民醫院藥劑科，廣東汕頭515098；4.廣東省中醫研究所中藥室，廣州515000

目的建立用高效液相色譜法（HPLC）測定復方清肺飲顆粒中淫羊藿苷含量的方法。方法采用C18色譜柱（200mm×4.6mm，5μm三津特納）；流動相：乙腈-水（30∶70）；檢測波長：270 nm。考察供試品和（或）對照品溶液的線性關系，HPLC的精密度、穩定性、重復性以及加樣回收率試驗和樣品測定。結果淫羊藿苷在4～36μg/ml（r=0.9998）范圍內有良好的線性關系。平均回收率為98.11%，RSD為2.55%。結論采用HPLC測定復方清肺飲顆粒中淫羊藿苷含量操作方法簡便、準確、靈敏度高，重復性好，可有效地用于復方清肺飲顆粒的質量控制。

復方清肺飲顆粒；淫羊藿苷；高效液相色譜法

復方清肺飲顆粒是本醫院的中藥自制制劑，組方：金銀花、黃芩、連翹、淫羊藿、紫花地丁、桔梗、枇杷葉、桑白皮等。臨床上用于治療肺、胃熱盛型的痤瘡、脂溢性皮炎等癥，效果確切。該方藥味眾多，成分復雜，其性質各不相同，為保證本制劑的科學性和質量穩定，本文采用高效液相色譜法對復方清肺飲顆粒方中主藥之一淫羊藿的主要有效成分——淫羊藿苷的含量進行測定，結果準確可靠。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JASCO 2000高效液相色譜儀（日本分光株式會社）；島津LC-10ATVP泵；ME5型精密電子分析天平（瑞士梅特勒．托利多公司）；ANASTAR色譜數據系統（美國TS公司）；BRANSO NSB3200超聲波清洗器；Sartorius PH酸度計（德國塞多利斯公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；SK 5200H型超聲波提取機（中國科導超聲儀器有限公司制造）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品（中國藥品生物制品檢定提供，供含量測定用），復方清肺飲藍顆粒為廣東省汕頭大學醫學院第一附屬醫院自制，所用藥材均為生產用同批藥。乙腈均為色譜純（CALEDON LABORATOR IESLTD．Canada），水為重蒸餾水，乙醇及其他試劑均為分析純。

1.3 檢測方法

1.3.1 色譜條件

采用C18色譜柱（200mm×4.6mm，5μm三津特納），流動相：乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 ml/min，檢測波長為270 mm；柱溫：25℃；進樣量：20μl。

1.3.2 溶液的制備

1.3.2.1 淫羊藿對照品配制精密稱取淫羊藿苷對照品，加75%乙醇溶液制成1.31mg/ml的對照品溶液[1]。精密吸取對照品溶液5μl，注入液相色譜儀。保留時間（Rt）=7.966 min，分離度（Rs）=10.78。

1.3.2.2 供試品溶液的制備精密稱取復方清肺飲顆粒內容物1 g，置于錐形瓶中，精密稱定，精密加入75%乙醇溶液50 ml，密塞，稱定重量，超聲提取30 mim，放冷，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取連續濾液15 ml，用75%乙醇溶液定容于25ml容量瓶中，即得。精密吸取供試品溶液5μl，注入液相色譜儀[2]。Rt=8.111min，Rs=8.17。

1.3.3 標準曲線的繪制精密稱取淫羊藿苷對照品1.4mg，置50ml容量瓶中，加75%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，精密吸取該溶液1、3、5、7、9ml置25ml容量瓶中，加75%乙醇溶液配制成濃度為2.8、5.6、11.2、22.4、28.0μg/ml的對照品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積積分值，以峰面積為縱坐標，相應濃度為橫坐標進行性回歸，得回歸方程為A=27569．38C+ 6275．3（r=0.9998），線性范圍為4～36μg/m1。

2 結果

2.1 精密度試驗

按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進行樣品采集。吸取溶液20μl，按“1.3.1”項下色譜條件進樣，色譜條件重復進樣6次，測定淫羊藿苷色譜峰面積積分值，結果RSD=1.02%（n=6）（表1）。

表1 淫羊藿苷樣品精密度試驗結果

2.2 穩定性試驗

精按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進行樣品采集。按“1.3.1”項下色譜條件進樣，色譜條件于0、1、2、4，8、16、24 h時，分別進樣20μl，測定淫羊藿苷峰面積積分值，RSD=1.02%（n=7），結果表明，樣品溶液在24 h內穩定（表2）。

表2 淫羊藿苷樣品穩定性試驗結果

2.3 重現性試驗

取同一批樣品（批號：20130413），按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進行樣品采集，按“1.3.1”項下色譜條件進樣，色譜條件平行測定6次，結果，平均含量為769．56μg/g，RSD=1.17%（表3）。

表3 淫羊藿苷樣品重現性試驗結果

2.4 加樣回收率試驗

準確稱取已知含量的樣品適量，并準備加入一定量的淫羊藿苷對照品，按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進行樣品采集，按“1.3.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積積分值，計算回收率，樣品中淫羊藿苷的含量測定結果見表4。

表4 樣品中淫羊藿苷的加樣回收率試驗結果

2.5 樣品含量測定

精密稱取4批樣品各1 g，按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進行樣品采集，即得制成供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進樣，分別測定淫羊藿苷含量，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果

3 討論

復方清肺飲顆粒藥味眾多，成分復雜，其性質各不相同。方中淫羊藿的主要成分為淫羊藿苷，相關研究表明，淫羊藿苷對家兔有降低外周阻力和較緩和的降壓作用，還能提高腎上腺皮質功能。為保證本制劑的科學性和質量穩定，本文根據《中國藥典》（2005年版·一部）采用高效液相色譜法對復方清肺飲顆粒方中主藥之一淫羊藿的主要有效成分——淫羊藿苷的含量進行測定。目前高效液相色譜法已逐漸成為中藥檢驗的最重要分析手段，在中藥及天然藥物有效成分含量測定中發揮日益重要的作用[3-4]，對于其藥效、藥理學的研究具有重要意義，但尚不能全面而準確地反映附子藥材中的精確藥效成分[5]。曾試過乙腈-水（25∶75）作為流動相，結果淫羊藿苷與鄰近峰分離不理想，最后改用高效液相色譜法測定復方清肺飲顆粒中淫羊藿苷含量，本方法峰形對稱，且分離度較好。實驗結果顯示，淫羊藿苷在4～36μg/ml范圍內有良好的線性關系（r=0.9998）。平均回收率為98.11%，RSD為2.55%。在提取方法的選擇方面，則選用目前通用的標準方法，即根據淫羊藿的性質進行提取。在線性關系考察、精密度實驗、穩定性試驗、重復性試驗、加樣回收率試驗和樣品測定等方面，本研究結果與類似文獻[6-15]研究水平基本一致。

綜上所述，高效液相色譜法能夠較好地分離淫羊藿中的淫羊藿苷成分，高效液相色譜法操作簡便、分離效果好，重現性高、結果準確可靠，具有實際應用意義。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：36-37.

[2]朱炳輝.安神補腦液中淫羊藿甙含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，1995，5（6）：8.

[3]國家藥典委員會.中國藥典·一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005：577．

[4]楊戒嬌.柱層析-高效色譜法測定乳增寧片中淫羊藿苷含量[J].中國藥房，2004，15（9）：565-566．

[5]雷永濤，梁妍，郝小燕，等.不同產地淫羊藿中四種活性成分含量的高效液相色譜法測定[J].時珍國醫國藥，2013，24（6）：1404-1405.

[6]韓麗萍，陳行愉，劉志剛.HPLC法同時測定抗骨質疏松中成藥中柚皮苷及淫羊藿苷的含量[J].中國藥房，2010，21（9）：43.

[7]劉麗華，高淑麗，孫宇紅，等.HPLC法測定仙靈骨葆顆粒中淫羊藿苷的含量[J].河北醫藥，2009，31（6）：15.

[8]Namkoong S，Chung BH，Ha KS.Microscopic technique for the detection of nitrc oxide-dependent angiogenesis in an animalmode[J].Methods Enzymol，2008，441：393-402.

[9]Chung BH，Kim JD，Kim CK，etal.Icariin stimulates angiogenesis by activating the MEK/ERK-and PI3K/Akt/eNOS-dependent signal pathways in human endothelial cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2008，376（2）：404-408.

[10]孟寧，孔凱，李師翁.淫羊藿屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J].西北植物學報，2010，30（5）：1063-1073.

[11]李曉龍，劉虹宇，曹佩雪，等.HPLC同時測定21種淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（5）：137-140.

[12]張玉萱，徐玲玲.淫羊藿總黃酮的藥理作用研究進展[J].實用臨床醫藥雜志，2012，16（9）：125-128.

[13]楊文波，段玉梅.高效液相色譜法測定壯腎安神片中淫羊藿苷的含量[J].黑龍江醫藥，2004，17（6）：415-417.

[14]韓昱，劉蓮英，郭耀武.HPLC法測定益腎靈膠囊中淫羊藿苷的含量[J].中國藥品標準，2004，5（1）：42-43.

[15]李紹平，張平，夏泉，等.反相高效液相色譜法測定淫羊藿總黃酮膠囊中淫羊藿苷含量[J].時珍國醫國藥，2003，14（2）：65-66.

[16]王明權，畢志明，李萍，等.高效液相色譜法測定淫羊藿中淫羊藿定C和淫羊藿苷的含量[J].中國中藥雜志，2003，28（11）：1025-1027.

Content study of icariin in com pound qingfeiyin granule determ ined by high performance liquid chromatography

SHIYuan-hong1LIU Zhen-feng2LIZhen-bo3CHEN Yu-xing4
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College in Guangdong Province, Shantou 515041,China;2.Department of Pharmacy,Prevention and Treatment Hospital of Skin Venereal Disease of Shantou City in Guangdong Province,Shantou 515041,China;3.Department of Pharmacy,Hepu People′s Hospital in Haojiang District of Shantou City in Guangdong Province,Shantou 515098,China;4.Room of Chinese Materia Medica, Guangdong Institute of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 515000,China

Objective To establish themethod of determining icariin content from compound qingfeiyin granule by high performance liquid chromatography(HPLC).M ethods C18chromatographic column(200 mm×4.6 mm,5μm three jin turner)was applied.Themobile phase was acetonitrile and water in ratio of 30 to 70.The detection wavelength was 270 nm.The linear relation of test samples solution and(or)reference sample solution was observed.The precision,stability, and repeatability of HPLC,added recovery rate test,and sample determination were also observed.Results Icariin had a good linear relation ranging from 4μg/ml to 36μg/ml(r=0.9998).The average recovery rate was 98.11%,and relative standard deviation(RSD)was 2.55%.Conclusion Operational approach of content determination of icariin in compound qingfeiyin granule by HPLC is simple and accurate with high sensitivity and good repeatability,it can be effectively used in quality control of compound qingfeiyin granule.

Compound qingfeiyin granule;Icariin;High performance liquid chromatography

R927.2

A

1674-4721（2015）04（c）-0007-03

2014-12-24本文編輯：許俊琴）

廣東省汕頭市醫療科技計劃項目（汕府科[2013] 88號）