HPLC法測定黃魚中酸性橙Ⅱ染料

馮曉青 劉華良 阮麗萍 王 芹 王 露 汪 怡 杭學宇

(1.淮安市疾病預防控制中心， 淮安 223001；2.江蘇省疾病預防控制中心，南京 210009)

儀器應用

HPLC法測定黃魚中酸性橙Ⅱ染料

馮曉青1劉華良2阮麗萍2王 芹1王 露1汪 怡1杭學宇1

(1.淮安市疾病預防控制中心， 淮安 223001；2.江蘇省疾病預防控制中心，南京 210009)

建立了操作簡便、靈敏度較高的HPLC測定黃魚中酸性橙Ⅱ的方法。樣品經均質，取2 g粉碎樣品，乙醇震蕩提取5 min，提取液經聚酰胺固相萃取柱分離凈化，采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)分離，以甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫，流速為1 mL/min，設定柱溫30 ℃，進樣體積為10 μL，二極管陣列檢測器在λ=485 nm處檢測酸性橙Ⅱ(λ=485 nm)。酸性橙Ⅱ在0.1 μg/mL～20 μg/mL的范圍內，呈良好的線性響應，線性方程為y=34.94x-2.697，r=0.9998。酸性橙Ⅱ檢出限為0.08 μg/mL。樣品添加濃度為0.5 mg/kg～15 mg/kg時，方法回收率為96%～99%，相對標準偏差為3.4%～7.3%。該法用于黃魚中的酸性橙Ⅱ的含量測定，操作簡便，定量準確可靠。

酸性橙Ⅱ 黃魚 HPLC

色素酸性橙Ⅱ又名金橙Ⅱ，二號橙，桔黃橙，酸性金黃Ⅱ或酸性艷橙GR，俗名金黃粉，化學名為2-萘酚偶氮對苯磺酸鈉。酸性橙Ⅱ是一種工業染料，主要用于蠶絲、羊毛織品和皮革的染色，禁止作為食品添加劑使用。在食品中違規添加酸性橙Ⅱ，極大危害消費者的身體健康。衛生部重新匯總發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單》中“產品類別”增加“鮑汁、腌鹵肉制品、紅殼瓜子、辣椒面和豆瓣醬”。但因酸性橙為化工原料，目前對食品中酸性橙Ⅱ的檢測在國家標準及地方標準中仍是空白。

文獻報道酸性橙Ⅱ的測定方法有紙層析法、分光光度法、反相高效液相色譜法和液相色譜串聯質譜法等[1-8]。本實驗旨在通過研究和優化酸性橙Ⅱ的試驗參數，建立快速、準確、實用的高效液相色譜檢測方法，為黃魚的市場質量監督以及安全檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國安捷倫公司)，二極管陣列檢測器及數據處理器；超聲波清洗器(KH-250DB，昆山禾創公司)；食品粉粹機(歐科電器有限公司)；離心機(H-1850R，湘儀儀器廠)；漩渦混勻器(SI-T256，美國Scientific Industries公司)；氮吹儀(DB-3D，英國TECHENE公司)；固相萃取裝置(DG-12，美國Supelco公司)。酸性橙Ⅱ標準品(Sigma公司，批號：213031462)；甲醇(色譜純，批號：1205254)；乙醇、氨水等均為分析純；聚酰胺固相萃取柱(1000 mg/6 mL，北京康農興牧科技發展中心)；黃魚購自市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

將黃魚樣品打碎成肉泥狀，混勻后準確稱取2 g粉碎樣品于15 mL具塞離心管中，加入10 mL乙醇震蕩提取5 min，以5000 r/min的速度離心5min，取上清液于另一離心管中，在殘渣中加乙醇10mL，再重復提取一次，合并兩次上清液，備用。聚酰胺固相萃取柱依次用3mL水、3mL乙醇活化，提取上清液過柱，控制流速小于2mL/min。用3 mL水和3 mL 乙醇淋洗，乙醇-氨水-水溶液4 mL洗脫，收集洗脫液，于80 ℃氮氣氛圍下吹干，用1.0 mL流動相溶解殘余物，渦旋1 min，以10000 r/min的速度離心5 min，取上清液，供高效液相色譜測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)或性能相當者；流動相：甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液；流速：1 mL/min，梯度洗脫見表1；柱溫：30 ℃；檢測波長：484 nm；進樣體積：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.2.3 標準曲線繪制

精確稱取0.100 g酸性橙Ⅱ，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的酸性橙Ⅱ標準貯備液。吸取標準貯備液，用流動相稀釋配制成濃度分別為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL的系列標準溶液，繪制工作曲線。

1.2.4 測定方法

取試樣溶液和相應的對照溶液，作單點或多點校準，按外標法，以峰面積計算。對照溶液及試樣溶液中酸性橙Ⅱ的響應值應在儀器檢測的線性范圍之內。

2 結果與討論

2.1 波長選擇

取5.0 μg/mL的酸性橙Ⅱ標準液，按1.2.2的色譜條件進樣，在波長為200 nm～600 nm的范圍內對酸性橙Ⅱ進行全掃描(圖1)，選定484 nm作為檢測波長。

圖1 酸性橙Ⅱ的吸收光譜圖

2.2 流動相及洗脫方式的選擇

試驗中采用了甲醇-乙酸銨(80∶20)溶液、甲醇-乙酸銨(15∶85)溶液和甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫3種流動相。結果表明，采用甲醇-乙酸銨(80∶20)溶液洗脫時，出峰時間過短，甚至不出峰，色素和干擾物之間均不能實現很好的分離；采用甲醇-乙酸銨(15∶85)溶液洗脫時，出峰時間過長，峰型較寬與干擾物難以分離；采用甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫，從圖2中可以看出效果理想，基線穩定，靈敏度高，峰型尖銳，雜質干擾少。因此，本實驗選擇甲醇-乙酸銨溶液梯度洗脫方式。

圖2 酸性橙Ⅱ標準溶液的液相色譜圖(濃度為5.0 μg/mL)

2.3 抗干擾實驗

考慮到樣品中的常見添加劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜等(1mg/mL)，對上述添加劑進行全掃描，上述物質在可見波長下無響應，不干擾測定(圖3)。向樣品中分別按通常使用量加入常用人工合成食用色素檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅等，均不干擾測定(圖4)。

圖3 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜混合紫外-可見掃描圖

圖4 檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅及酸性橙Ⅱ混合色譜圖

2.4 線性關系及檢測限

酸性橙Ⅱ標準工作液系列，按方法的實驗條件進樣，以所得峰面積A對濃度C(μg/mL)進行回歸分析，結果表明在0.1μg/mL～20 μg/mL的標準溶液濃度范圍內，酸性橙Ⅱ濃度與響應值有良好的線性關系(圖5)，其回歸方程為：y=34.94x-2.697；相關系數：r=0.9998。根據色譜響應值S/N≥3標準計算，酸性橙Ⅱ檢出限為0.08 mg/L。

圖5 酸性橙Ⅱ標準工作曲線圖

2.5 精密度實驗

以酸性橙Ⅱ標準溶液5.0 μg/mL，連續進樣6次，每次10 μL，測得酸性橙Ⅱ平均峰面積為162.17，RSD為0.13%。

2.6 穩定性實驗

以標準溶液5.0 μg/mL，每隔2 h進樣，每次10 μL，測得酸性橙平均峰面積為164.57，RSD為0.150%。結果表明：供試品溶液在12 h內所測得的結果基本一致。

2.7 重復性實驗

取同一黃魚樣品6份，按1.4.2的方法制成供試溶液。在上述色譜條件下，測定酸性橙Ⅱ(圖4)平均含量為4.45 mg/kg，RSD為1.54%。

2.8 回收率實驗

稱取已知酸性橙Ⅱ含量(4.45 mg/kg)的陽性樣品9份，分別作5.00 mg/kg、10.00 mg/kg、15.00 mg/kg 3種濃度的加標回收實驗，按1.4.2的方法制成供試品溶液，并按上述色譜條件測定堿性橙的含量，計算回收率(表2)。結果表明，這3種濃度的加標回收率在97.4%～99.2%之間，RSD在3.39%～4.72%之間。

表2 陽性樣品中性橙Ⅱ的添加回收率、精密度(n=3)

另取一陰性樣品(圖5)進行低濃度的加標回收實驗，結果見表3。該陰性樣品中添加水平為0.50 mg/kg、1.00 mg/kg、2.00 mg/kg，回收率在95.6%～97.3%之間，RSD在4.32%～7.31%之間。

表3 空白樣品中性橙Ⅱ的添加回收率、精密度(n=3)

3 結論

本方法操作簡便，精密度高，回收率好，在0.1μg/mL～20 μg/mL的濃度范圍內線性關系良好，為酸性橙Ⅱ標準方法制定提供理論支持及市場上染色黃魚制品的衛生監督提供較好的判定依據。

[1]陳大義.紙層析定性示波極譜法測定非食用色素酸性橙[J].中國衛生檢驗志，2001，11(2):170-171.

[2]雷波.分光光度法對混合染料濃度的同時測定[J].染整技術，2003，25(3)：35-37.

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Determination of acid orangeⅡin yellow croaker by HPLC.

Feng Xiaoqing1，Liu Hualiang2,Ruan Liping2, Wang Qin1, Wang Lu1,Wang Yi1,Hang Xueyu1

(1.HuaianCenterforDiseaseControlandPrevention,Huaian223001,China;2.JiangsuCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China)

A method for determination of acid orangeⅡ in yellow croaker, was developed.Samples were homogenized, 2 grams of sample were extracted with ethanol for 5 minutes. The extract was separated and purified by polyamide solid phase extraction column. The HPLC separation was achieved by using C18(250 mm×4.6 mm，5μm) with a mobile phase consisting of methanol and acetate buffer, and the gradient program was used at a flow rate of 1 ml/min.The column temperature was set at 30 ℃ and the injection volume was 10 μl. The detection wavelength was at 485 nm for acid orangeⅡ, then we selected the best chromatograph conditions to determine the concentration of acid orangeⅡ in yellow croaker and its added standard recoveries. This method exhibited a linear relation within 0.1-20 μg/ml acid orangeⅡ content. The regression equation was y=34.94x2.697 ( r=0.9998) and the minimum detectable limit of this method was 0.08μg/ml. The recoveries were 96%-99%, the relative standard deviations(RSDs) were 3.39%-7.31% while the contents of added standard were 0.5-10 mg/kg. The method is simple, accurate and reliable.

acid orangeⅡ; yellow croaker; HPLC

馮曉青, 男 ,技師 ,研究方向為衛生檢驗,Email:fengxiaoqing-20@163.com.。

杭學宇 ，男 ，副主任技師 ，研究方向為理化檢驗，Email:664686545@qq.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2015.04.004

2015-01-19