短芒大麥草青貯微生物特性研究及優良乳酸菌篩選

陶雅，李峰，高鳳芹，孫啟忠*

(1.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010；2.農業部牧草資源與利用重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010010)

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短芒大麥草青貯微生物特性研究及優良乳酸菌篩選

陶雅1,2，李峰1，高鳳芹1,2，孫啟忠1,2*

(1.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010；2.農業部牧草資源與利用重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010010)

以短芒大麥草為研究對象，利用傳統培養法從葉圍和青貯發酵體系中分離出乳酸菌、大腸桿菌、好氧細菌、酵母菌和霉菌，并計數；結合細菌形態學、生理生化特征及16S rDNA序列分析鑒定分離出的乳酸菌菌株；通過研究乳酸菌的生長曲線、產酸特性及耐酸性，篩選優質乳酸菌。以期探明短芒大麥草葉圍及青貯發酵體系中微生物菌群特性及青貯料中乳酸菌多樣性，篩選出具有促發酵效果的乳酸菌菌株，為有益微生物飼料研發奠定基礎。試驗結果表明，短芒大麥草經青貯發酵后各微生物菌群數量發生不同程度變化，乳酸菌數量由0 cfu/g FM增加到4.00×108cfu/g FM，酵母菌數量由8.50×105cfu/g FM增加到1.02×108cfu/g FM，而好氧細菌、大腸桿菌和霉菌數量變化不明顯；從短芒大麥草青貯發酵體系分離得到4株乳酸菌，經鑒定Lx36為Lactobacilluspentosus，Lx37為Lactobacillusbrevis，Lx53為Pediococcuspentosaceus，Lx54為Lactobacillusparabuchneri；篩選得到1株益于青貯的乳酸菌株Lx36，約在20 h后進入穩定生長期，OD值達到4.21，且發酵12 h的pH僅為4.08，并可以在pH=3.0環境條件下生長。綜上所述，青貯發酵是體系中各種微生物相互作用的過程，微生物菌群的數量及變化直接影響青貯飼料發酵品質。短芒大麥草青貯飼料中乳酸菌種類較豐富，篩選得到的戊糖乳桿菌繁殖速度快、產酸能力強同時表現出了較強的耐酸性，具有潛在的生產應用價值，適宜用作促發酵的青貯添加劑菌種。

短芒大麥草；青貯；微生物特性；乳酸菌

短芒大麥草(Hordeumbrevisubulatum)產量高、適口性好、適應性廣且具有較強的耐鹽性，其青草利用期長、葉量豐富、草質柔軟、營養品質好、粗蛋白含量高，是一種良好的放牧—刈割兼用型多年生禾草[1-3]。開發短芒大麥草青貯飼料，能夠有效地利用青綠植物中的營養成分、提高飼料的適口性、擴大飼料來源、解決季節性飼草不平衡、促進飼料的均衡供應。

乳酸菌是影響青貯發酵品質的主要因素之一。近年，歐美畜牧業發達的國家及日本致力于開發乳酸菌等添加物，改善青貯飼料的發酵品質和營養價值的研究。而我國對于青貯乳酸菌的研究起步比較晚，對青貯乳酸菌資源的收集、發酵特性以及遺傳特性研究比較落后，擁有自主知識產權的乳酸菌及其制劑較少[4]，得到大量推廣應用的更是微乎其微。本試驗以短芒大麥草為材料，對青貯過程中起作用的微生物菌群進行初步研究，探明該青貯料中乳酸菌多樣性，并選出性狀優良的乳酸菌，為制備有益微生物飼料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1青貯原料

以短芒大麥草為供試材料，采自內蒙古赤峰市林西縣良種場，于2013年8月短芒大麥草處于初花期，從田間按梅花形布點法選取5個區域取樣刈割。

1.2青貯調制

將刈割的短芒大麥草鍘成2～3 cm，充分混合均勻后，按照四分法選取適量的樣品裝入聚乙烯袋，設3次重復，每袋約200 g，用真空包裝機抽成真空并封口，室溫條件下放置60 d后開封取樣分析。

1.3儀器設備

生物安全柜為ESCO公司的AC2-S型；恒溫培養箱為MEMMERT公司的INB400型；立式壓力蒸汽滅菌器為上海申安醫療器械廠的LDZX-50KBS型；臺式恒溫搖床為太倉市實驗設備廠的THZ-D型；光學顯微鏡為OLMPUS的 BX51型；高速冷凍離心機為Thermo公司Fresco 21型；PCR儀為BIO-RAD的Peltier Thermal Cycler；凝膠成像儀為ALphaImage；電泳儀為北京六一儀器廠的dyy-6c型；紫外分光光度計為北京普析通用儀器有限責任公司的TU-1901型。

1.4培養基及試劑

液體、固體MRS培養基、NA培養基和PDA培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司；BLB培養基購自日水制藥株式會社；細菌全基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、溶菌酶等購自天根生化科技有限公司；擴增引物購自上海桑尼生物科技有限公司。

1.5試驗方法

1.5.1微生物計數 采用稀釋平板涂布法對短芒大麥草原料和青貯料中微生物菌群進行計數，稱取5 g待測樣品，放入裝有45 mL無菌水的三角瓶內，置于搖床振蕩30 min，將得到的溶液繼續用無菌水做10倍梯度的稀釋，分別吸取10-1，10-3和10-5三個稀釋度懸液20 μL，均勻涂于MRS、BLB、NA和PDA平板培養基上，MRS培養基上的菌落(乳酸菌)于37℃厭氧環境下培養，BLB、NA和PDA培養基上菌落(大腸桿菌、好氧細菌、酵母菌和霉菌)則直接置于37℃恒溫培養箱內，48 h后對各平板上的菌落數進行計測。

1.5.2乳酸菌的分離與純化 挑取MRS培養基上生長的典型菌落，在MRS平板上反復劃線分離，直到獲得該菌的純培養。對獲得的各菌株進行革蘭氏染色[5]和過氧化氫酶試驗[6]。凡是呈革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株，均認為是疑似乳酸菌，保存備用。

1.5.3乳酸菌的生理生化特征鑒定 乳酸菌發酵葡萄糖產氣試驗參照凌代文和東秀珠[6]的方法進行。在不同溫度(10，15，40，45℃)、pH(pH=3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，7.5，8.0)和NaCl濃度(3.0%和6.5%)條件下生長試驗以及利用API 50CH檢測乳酸菌對49種不同碳源發酵能力檢測參照Duan等[7]方法進行。

1.5.4乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析及系統進化樹的構建 乳酸菌DNA的提取按照天根細菌全基因組DNA提取試劑盒說明進行。以提取菌株的DNA為模板，應用引物序列27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′進行PCR擴增，PCR反應體系(50 μL)為：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物27f和1492r(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL，加ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；94℃，變性50 s；55℃，退火50 s；72℃，延伸2 min，30個循環后，72℃延伸10 min，4℃保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，PCR擴增片段約為1500 bp，將PCR產物送上海桑尼生物科技有限公司進行雙向測序。將測序獲得的所有菌株序列信息利用Blast檢索系統在GenBank數據庫中進行Blast比對，選擇適當數量與目的基因序列同源性相對較高的標準菌株的16S rDNA序列與測定菌株的16S rDNA序列，共同用MEGA 5.1軟件構建系統進化樹。

1.5.5產酸速率測定 將乳酸菌按3%的接種量轉入MRS液體培養基中，于37℃培養12 h，每隔2 h測定不同菌株發酵液pH，以培養時間為橫坐標，pH為縱坐標繪制產酸速率曲線[8]。

1.5.6生長曲線的測定 將乳酸菌按3%的接種量轉入MRS液體培養基中，于37℃培養36 h，每隔2 h取1次樣品,在620 nm下測定樣品的吸光度值，以培養時間為橫坐標，對應的吸光度值為縱坐標繪制生長曲線[8]。

2 結果與分析

2.1短芒大麥草葉圍及青貯體系微生物計數

短芒大麥草新鮮樣品與青貯樣品中微生物種類和數量見表1，新鮮樣品上附著的微生物數量最多的是好氧細菌，為3.15×107cfu/g FM，其次是大腸桿菌和酵母菌，而乳酸菌和霉菌未檢測到，經過青貯發酵后，乳酸菌數量明顯增多，達到了4.00×108cfu/g FM，酵母菌的數量也有所增加，而大腸桿菌、好氧細菌和霉菌數量幾乎沒有變化。

表1 短芒大麥草微生物計數Table 1 Microbiological analysis of the H.brevisubulatum cfu/g FM

cfu：菌落形成單位Colony forming unit；FM：鮮物質Fresh matter.

2.2乳酸菌的生理生化特征

從短芒大麥草青貯樣品中共分離出4株乳酸菌，分別命名為Lx36、Lx37、Lx53、Lx54，各菌株生理生化特征見表2、3。 所有分離到的菌株均表現為革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性，其中Lx36和Lx53發酵葡萄糖不產生CO2，屬同型發酵乳酸菌，而Lx37和Lx54為異型發酵乳酸菌；根據這4株乳酸菌生理生化特性可將其分成2個類群：類群Ⅰ包含Lx36、Lx37、Lx54，這3株菌均為桿菌，可在40℃、45℃、3.0% NaCl濃度和pH=4.5，5.0，7.5，8.0的環境條件下生長，其中Lx36在5和10℃下不生長，Lx37在5℃、6.5% NaCl濃度和pH=3.0，3.5，4.0條件下弱生長，Lx54在6.5% NaCl濃度和pH=3.0條件下不生長，而在pH=3.0時弱生長。這3株菌均可以利用果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、密二糖和葡萄糖酸鹽，其中Lx36可以發酵苦杏仁苷、纖維二糖、甘露醇、甘露糖、海藻糖，而Lx37和Lx54不能發酵這幾種碳源，Lx54可以發酵松三糖、棉籽糖和蔗糖，而Lx37不能利用這幾種碳源，所以將3株菌株初步鑒定[6，9]屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)；類群Ⅱ包含Lx53，該菌為球菌，在5℃和pH=3.0，3.5條件下不生長，可以發酵核糖、麥芽糖、海藻糖和熊果苷，不能利用松三糖、鼠李糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇和α-甲基-D-葡萄糖苷，其生理生化性狀與片球菌屬相似，初步鑒定屬于片球菌屬(Pediococcus)。

2.3乳酸菌的16S rDNA 序列分析以及系統發育樹構建

將測序獲得的所有16S rDNA序列信息在NCBI數據庫和EzTaxon數據庫中進行Blast相似性比對，結果見表4。所有序列與數據庫中已知16S rDNA基因序列的相似性均在99.0%～100.0%之間。

表2 青貯飼料中乳酸菌的生理生化特征Table 2 The physiological biochemical characteristics of lactic acid bacteria strains isolated from silage

+：生長Positive；-：不生長Negative；w：微弱生長Weakly positive.

由系統發育分析可以看出(圖1)，4株乳酸菌分別屬于乳桿菌屬和片球菌屬，其中：Lx36與Lactobacilluspentosus的系統位置最接近，相似度為100.00%，Lx37與Lactobacillusbrevis處于同一進化分支上，相似度達100.00%，Lx53與Pediococcuspentosaceus的系統進化位置最接近，相似度為99.97%，Lx54與Lactobacillusparabuchneri處于同一進化分支上，相似度達100.00%。

2.4乳酸菌生長曲線及繁殖速度比較

4株乳酸菌的生長曲線見圖2，從曲線中可以看出4株乳酸菌均在2 h后進入對數生長期，其中Lx53、Lx54和Lx37約在14 h左右進入穩定生長期，生長速度依次遞減，生長較為緩慢，而Lx36生長速度較快，明顯高于其他3株乳酸菌，約在20 h后進入穩定生長期，20 h時其OD值達到4.21。可見4株乳酸菌中Lx36的繁殖速度最快。

2.5乳酸菌產酸速率及產酸能力比較

4株乳酸菌發酵過程中產酸速率曲線如圖3所示。從圖中可以看出，Lx37和Lx54發酵液的pH下降較為緩慢，發酵12 h的pH分別為5.28和5.35，Lx53發酵液的pH下降較快，發酵12 h的pH為4.51，而Lx36發酵液的pH下降最快，從2 h便開始急劇下降，其發酵12 h的pH僅為4.08。可見4株乳酸菌中Lx36的產酸能力最強。

表3 乳酸菌API 50 CH 碳源發酵結果Table 3 API 50 CH fermentation patterns of lactic acid bacteria strains isolated from silage

+：90%菌株為陽性90% or more of the strains are positive；-：90%菌株為陰性90% or more of the strains are negative；w：弱陽性Weakly positive.

表4 乳酸菌株16S rDNA序列Blast比對結果Table 4 Blast results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

3 討論

青貯發酵過程是各種微生物共同作用的結果，參與青貯過程的微生物包括青貯原料上附著的微生物，引起青貯飼料發酵的微生物以及引起青貯腐敗變質的微生物等[10]，在整個青貯過程中微生物的數量存在動態變化[11]。Kobayashi等[12]研究認為，附生乳酸菌的數量影響最終發酵品質，如果牧草表面附生乳酸菌數量過低，則會導致青貯料發酵品質和營養價值下降。檢測附生乳酸菌的數量可以預測自然青貯發酵充分與否及是否有必要添加菌劑促進發酵[13]。本研究中短芒大麥草青貯前后乳酸菌數量變化較大，青貯前并未在新鮮樣品上檢測出乳酸菌，青貯發酵后樣品中乳酸菌含量高達108cfu/g FM，酵母菌的數量由105cfu/g FM變化到108cfu/g FM，而大腸桿菌、好氧細菌和霉菌的數量變化不明顯。可見短芒大麥草在青貯發酵過程中，隨著厭氧和酸性環境的形成，乳酸菌迅速繁殖，數量增加；酵母菌在厭氧條件下可利用青貯飼料中的糖分進行繁殖，數量也有所增加；大腸桿菌和部分好氧細菌，耐酸性不強，當發酵體系pH逐漸降低時，這兩類細菌的生長受到抑制，但是可能由于短芒大麥草附生乳酸菌數量太低，導致發酵效果不理想[12]，青貯后發酵體系pH并未迅速降低到能夠顯著抑制這兩類細菌的程度，所以其數量沒有顯著降低。Zhang[14]研究了青貯原料和青貯料中微生物種類和數量，青貯前乳酸菌數量在101～107cfu/g、腸細菌數量為102～108cfu/g、酵母菌數量為101～107cfu/g、霉菌數量為102～106cfu/g，青貯后這幾類微生物數量分別為105～109cfu/g、低于102cfu/g、102～106cfu/g和104cfu/g，本研究結果基本與其相符，但短芒大麥草青貯后腸細菌和酵母菌數量較高。

圖1 基于 16S rDNA 序列分析結果的系統發育樹

圖2 乳酸菌生長曲線

圖3 乳酸菌產酸速率曲線

本研究對短芒大麥草青貯乳酸菌多樣性研究在國內外尚屬首例，通過MRS培養基從短芒大麥草青貯發酵體系分離得到4株乳酸菌，根據表型特征、生理生化特性初步鑒定3株屬于乳桿菌屬，1株屬于片球菌屬，桿菌較球菌豐富。通常情況下乳酸桿菌對酸的耐受性要高于乳酸球菌，當環境酸度較高時，乳酸球菌的生長受到抑制，活力降低、數量減少[9]。由于分離出的4株乳酸菌碳源發酵模式與模式菌株均存在差異，因此單純利用表型相似性并不能把這些菌株鑒定到種的水平。16S rDNA序列分析既可以在種屬水平上對細菌進行較為準確的鑒定，也可以對細菌亞種進行鑒定[15]，經分析4株菌的16S rDNA序列與參考菌株的16S rDNA 序列相似性都在99%以上，因此Lx36鑒定為Lactobacilluspentosus，Lx37鑒定為Lactobacillusbrevis，Lx53鑒定為Pediococcuspentosaceus，Lx54鑒定為Lactobacillusparabuchneri。

乳酸菌是促使青貯飼料發酵的主要微生物，將其用作飼料青貯的生物添加劑，可有效地調節青貯料內微生物區系，抑制有害菌的活動[16-17]，調控青貯發酵過程，從而提高青貯發酵品質。因此那些繁殖速度快，產酸、耐酸能力強的乳酸菌常被篩選出來用作發酵促進劑[18]。早期用作青貯添加劑的菌株大部分來自奶牛及乳產品[19]，但是結果并不理想，而從青貯飼料中分離出的乳酸菌更宜適應青貯環境，從中篩選青貯用優良乳酸菌則為一種高效、快速的方法。通過研究短芒大麥草青貯飼料中分離出4株乳酸菌的生長特性、產酸特性以及耐酸性，發現戊糖乳桿菌Lx36為同型發酵乳酸菌，可以迅速繁殖，使酸性快速下降，并且耐酸，這些完全符合Whittenbury[20]、Wieringa和Beck[21]制定的乳酸菌劑篩選標準的一些核心觀點。戊糖乳桿菌廣泛存在于傳統發酵蔬菜、發酵乳制品、發酵肉制品及醉魚中[22-25]，長期的食用歷史使其被公認為具有發酵作用的安全菌[26]，張想峰等[27]從新疆小蘆葦青貯中分離出2株戊糖乳桿菌，發現其中1株具有較強的產酸能力，pH最低可達3.50, 是發酵過程中的主要產酸菌株，本試驗結果與此一致。可見Lx36具有潛在的生產應用價值，適宜用作促發酵的青貯飼料發酵菌株。

4 結論

青貯發酵是體系中各種微生物相互作用的過程，微生物菌群的數量及變化直接影響青貯飼料發酵品質。短芒大麥草附生乳酸菌數量極少，因此單獨青貯時最好加入適量乳酸菌劑以促進發酵，保證發酵完全。短芒大麥草青貯飼料中乳酸菌種類較豐富，共分離出4株乳酸菌，篩選得到的戊糖乳桿菌Lx36繁殖速度快、產酸能力強，同時表現出了較強的耐酸性，這一結果為其進一步開發用作青貯促發酵劑提供了理論依據。

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Microbial characteristics ofHordeumbrevisubulatumsilage and screening for lactic acid bacteria with high fermentation performance

TAO Ya1,2, LI Feng1, GAO Feng-Qin1,2, SUN Qi-Zhong1,2*

1.GrasslandResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Huhhot010010,China; 2.KeyLaboratoryofGrasslandResourcesandUtilization,MinistryofAgriculture,Huhhot010010,China

A study has been undertaken to investigate the microbial community structure, microorganism populations and diversity of lactic acid bacteria inHordeumbrevisubulatumsilage.Lactic acid bacteria, coliform bacteria, aerobic bacteria, yeast and mold were isolated and counted by means of selective media.Lactic acid bacteria strains were identified by morphological observation, physiological and biochemical characteristics and partial 16S rDNA gene sequences.In order to assist the development of beneficial microorganisms for animal feed, the lactic acid bacteria strains with high fermentation performance were screened based on growth curves and their ability to produce and resist acid.The results showed that microorganism populations change in different ways through the fermentation process.Lactic acid bacteria populations increased from 0 to 4.00×108cfu/g FM and yeast populations grew from 8.50×105to 1.02×108cfu/g FM, whereas coliform bacteria, aerobic bacteria and mold populations did not change significantly.Four lactic acid bacteria strains were isolated fromH.brevisubulatumsilage which were identified at Lx36 isolation asLactobacilluspentosus, at Lx37 isolation asL.brevis, at Lx53 isolation asPediococcuspentosaceusand at Lx54 isolation asL.parabuchneri.Lx36 was screened out for high fermentation performance because it ceased to grow after 20 hours of cultivation, with an OD value of 4.21.The pH value of MRS broth (the bacterial growth medium) was only 4.08 after 12 hours of Lx36 cultivation, and the strain can survive in MRS broth with a pH of 3.0.These results indicate that silage fermentation is a process of microorganism interaction and that silage quality is directly influenced by the changing character of microorganism populations.Lactic acid bacteria species inH.brevisubulatumsilage were relatively abundant.L.pentosusscreened with a high ability to reproduce and to produce and resist acid, suggesting its potential value for practical applications.

Hordeumbrevisubulatum; silage; microbial characteristics; lactic acid bacteria

10.11686/cyxb2015138

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-03-11；改回日期：2015-05-20

中央公益性行業(農業)科研專項經費項目(201203042)和中國農業科學院創新工程牧草栽培與加工利用(CAAS-ASTIP-IGR 2015-02)資助。

陶雅(1982-)，女，內蒙古呼和浩特人，助研，碩士。E-mail:taoya2001@126.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:sunqz@126.com

陶雅, 李峰, 高鳳芹, 孫啟忠.短芒大麥草青貯微生物特性研究及優良乳酸菌篩選.草業學報, 2015, 24(12):66-73.

TAO Ya, LI Feng, GAO Feng-Qin, SUN Qi-Zhong.Microbial characteristics ofHordeumbrevisubulatumsilage and screening for lactic acid bacteria with high fermentation performance.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):66-73.