血清堿性磷酸酶測定結果的溯源性研究

王衛兵

首都醫科大學，北京 100069

血清堿性磷酸酶測定結果的溯源性研究

王衛兵

首都醫科大學，北京 100069

一項血清酶測定結果的可溯源性研究發現，堿性磷酸酶（ALP）在多種生化分析儀上的測定結果與校正物的定值相差懸殊，并且不同來源的ALP試劑盒的測定結果間也存在高低不一的系統誤差。本文分析了系統誤差的產生原因，從理論和實驗兩個方面排除了生化分析儀的原因，指出影響ALP測定結果的關鍵因素是緩沖液的種類，并以此為例說明在進行血清酶活性測定結果的溯源、校正和室間比對時，必須考慮構成檢測系統的各個要素，包括試劑盒的性能質量和生化分析儀的參數設置。

堿性磷酸酶；生化分析儀；酶活性測定；結果溯源；室間質評

0 前言

在一項血清酶測定結果可溯源性研究[1]中，研究的組織者在某市三級醫院的50家檢驗科和其他臨床實驗室統一發放了由日本臨床化學協會（JSCC）推薦的酶參考物（ERM）1支（日本旭化成株式會社生產），隨后讓各實驗室在多種生化分析義上（主要包括日立、奧林巴斯和貝克曼全自動生化分析儀）按現行操作規程要求進行定標和室內質控測定，之后再測定ERM，重復測定10次，在指定日期內完成檢測，取均值上報給檢驗中心進行統計計算。研究者對50家實驗室的ERM測定結果均值與ERM標示值進行了比較，認為二者間的相對偏倚屬于系統誤差，其中相對偏倚最大的項目是堿性磷酸酶（ALP）。研究者對此指出，ALP測定結果顯著低于標準品標示值，不同試劑間的測定結果偏差較大，這與試劑中緩沖液的組成和種類有關，未明確ALP測定結果偏差的原因。筆者查對了該研究論文中列出的11個不同來源的ALP試劑盒的測定原理和試劑組成，現就ALP測定結果的溯源、校正和室間質評與試劑盒性能質量的關系討論如下。

1 ALP測定結果在EAE和2A 2M 1P緩沖系統間的系統誤差的原因分析

在筆者査對的11種試劑盒中，有8個試劑盒的測定結果低于標準品標示值，這些試劑盒使用的底物相同，均為對硝基酚磷酸二鈉，緩沖系統為2-氨基-2-甲基-1-丙醇（2A2M 1P）。不同ALP試劑盒選用的2A2M 1P濃度范圍為0.35～1.00 mol/L，pH范圍為10.2～10.9，ALP激活劑Mg2+濃度范圍為0.5～2.2 mmol/L（其中有用醋酸鎂的，也有用氧化鎂的），這8種試劑盒對標準品的測定結果比標示值低的程度范圍為30％～50％，不同試劑盒間的差異應該是由2A2M 1P緩沖液濃度、pH值和Mg2+濃度的差異造成的。如果檢測的酶標準品是在2A2M 1P緩沖系統內定值，那么這8種試劑盒的測定結果應該最接近定值。在室間質評的ALP測定方法分組時，此8種試劑盒應歸為一組，使用同一靶值，計算變異指數（VIS）和能力比對（PT）得分。那么為什么采用這8種ALP試劑盒檢測ERM的ALP活性會出現如此大的負偏倚呢？

筆者查閱了ERM中，ALP并不是在2A2M 1P緩沖液內定值，而是采用日本臨床化學協會（JSCC）的推薦方法定值[2]，緩沖液是2-乙基氨基乙醇（EAE），而美國臨床化學協會（AACC）和國際臨床化學聯合會（IFCC）推薦方法中采用的緩沖液為2A2M 1P[3]，德國臨床化學協會[4]（GSCC）和斯堪地那維亞臨床化學協會（SSCC）則推薦使用二乙醇胺（DEA）。在不同緩沖系統中，血清中ALP各型同工酶活性的表達程度不一。而在EAE中，ALP各型同工酶相對催化反應性較一致，即肝型100％、骨型90％、胎盤型89％、小腸型99％。而在DEA或2A2M 1P中，小腸型ALP的相對活性表達低于50％，在一些肝病血清中小腸型ALP也占相當大比例，故我國和JSCC推薦使用EAE作為緩沖液[5]。JSCC曾在EAE與DEA緩沖液系統中測定了一批血清的ALP活性，觀察了肝型、小腸型ALP在兩種緩沖系統中的活性表達（圖1）。由圖1可見，小腸型ALP在EAE中的活性比在DEA中高出約33％[6]。

圖1 兩種緩沖液（DEA和EAE）中ALP活性相關散點圖

筆者在一項比較研究中，用3種緩沖液系統同時檢測了高ALP活性血清的系列稀釋樣品，結果見圖2。由圖2可見，ALP活性在DEA中比在2A2M 1P中平均高出2倍以上；ALP活性在2A2M 1P中又比在碳酸鹽緩沖液高。在本研究納入的20例患者中，在DEA（Y）與碳酸鹽緩沖液（X）中測定血清ALP活性的相關系數（r）為0.99，回歸方程Y＝2.46X-5.99，回歸散點圖見圖3。分別以ALPEAE、ALPDEA、ALP2A2M 1P、ALPNaHCO3/Na2CO3代表4種緩沖液的ALP活性。若根據圖1～3的數據測定同一樣品的ALP活性，應呈現ALPEAE≈ALPDEA＞ALP2A2M 1P＞ALP NaHCO3/Na2CO3，這正是采用2A2M 1P緩沖液的8個不同來源的ALP試劑盒檢測ERM的ALP活性會出現較大負偏倚的原因。按照酶校正物可轉移性（Transferability）的定義，酶校正物只能在兩個表現有相同分析特異性的方法間轉移準確性，因此由JSCC法定值的ERM不適合在以2A2M 1P為緩沖液的ALP測定方法中轉移準確性。

圖2 堿性磷酸酶活性與緩沖液種類的關系

圖3 兩種緩沖液中血清堿性磷酸酶活性相關散點圖

2 ALP測定結果在EAE和DEA緩沖系統間的系統誤差的原因分析

由上所述，由JSCC法定值的ERM也不適合在以DEA為緩沖液的ALP測定方法中進行校正。由圖1可知，EAE和DEA分析特異性的不同主要表現在小腸型ALP在EAE中表達程度為99％，而在DEA中卻不足50％。IFCC和我國臨床檢驗學會否定DEA緩沖系統的原因有5點[5]：①DEA的pH反應曲線為過敏感曲線，對保證分析的重復性不利；②1 mol/L的DEA粘度大，在儀器分析中易產生交叉污染；③DEA的pH離最適pH較遠；④DEA試劑雜質中有ALP抑制劑；⑤不同型ALP同工酶活性表達差異相對較大。GSCC和SSCC主要依據緩沖液選擇的一般原則，即從多種緩沖液中選擇酶活性表達最高者，至于其他一些弱點可以用提高試劑純度、降低濃度等加以調整。

在11種檢測ERM的ALP試劑盒中，有兩種ALP試劑盒的檢測結果高于ERM的標示值，其中一種ALPDEA1的正偏倚約25％，另一種ALPDEA2的正偏倚竟高達80％，這兩種ALP試劑盒都為德國生產。經查產品說明書已明確ALPDEA2所用緩沖液是DEA，濃度0.35 mol/L，pH10.4，醋酸鎂16 mmol/L，ZnSO41.0 mmol/L，其中Mg2+濃度比上述任一ALP試劑盒中的Mg2+濃度都高，而且添加了Zn2+，這可能是ALPDEA2測定結果比ERM標示值高出80％的主要原因。Mg2+是ALP的激活劑，而血清內源性Mg2+濃度會因人而異，正常成人血清Mg2+濃度的參考范圍為0.74～1.03 mmol/L。Zn2+又是ALP的輔基，Zn2+-ALP為全酶（holo-ALP）具有活性，如失去Zn2+只剩下ALP的酶蛋白（apo-ALP）則無活性。考慮到大多數定值或非定值質控血清，甚至酶校正物在制備過程中會發生Zn2+丟失，在這些質控物質或校正物中就會存在不同比例的apo-ALP。依據上述結果，日本旭化成株式會社的ERM中必然存在較高比例的apo-ALP，因此在使用含有Zn2+的ALPDEA2試劑盒測定時，這些apo-ALP可得以表達。據此也可推斷，日本旭化成株式會社在給ERM定值的ALP試劑組分中缺Zn2+，沒有使apo-ALP轉化為holo-ALP。

據IFCC的ALP研究資料顯示，在ALPDEA2的試劑中，除有Zn2+外，還應有適量離子緩沖螯合劑N-羥基乙基乙二胺四乙酸（HEDTA）。這是因為：Zn2+/Mg2+之間存在對apo-ALP的競爭結合，如果反應液中Zn2+/Mg2+比例不當會導致ALP活性下降；因為Zn2+對apo-ALP的親和力比Mg2+高10倍，為防止Zn2+對Mg2+激活作用的解除，需要向試劑中添加適量HEDTA，利用Zn2+-HEDTA與Mg2+-HEDTA解離常數的不同，維持反應液Zn2+/Mg2+的適當比例，以實現ALP的最大活性表達。ALPDEA1測定結果不如ALPDEA2高的原因，即與Mg2+、Zn2+、HEDTA等在試劑盒生產中的運用是否科學合理有關[7]。

3 由ALP室間質評分析科學分組的重要性

在ALP室間質評中，底物相同都是對硝基酚磷酸鹽（4NPP），方法學分組應當主要依據采用何種緩沖體系。在RANDOX組織的－次跨國室間質評中，涉及1000多個參評實驗室，主要分為兩組：（4NPP，AMP，37℃）和（4NPP，DEA，37℃），兩組的回報結果（均值±2SD）確定的靶值分別是409 U/L和505 U/L（表1），可見方法組1（AMP）緩沖液與方法組2（DEA）緩沖液間的質評結果存在明顯系統誤差。

表1 RANDOX室間質評ALP回報數據分組統計結果

某國家在2007年組織了3次共15個調查樣品的室間質評，選擇其中一組數據（200721）來顯示兩個方法組的統計結果（表2），可見方法組1（AMP）緩沖液與方法組2（其他）緩沖液的質評結果均值基本相等。這種回報結果趨同性是由于方法學分組不科學，再加上其他原因造成的，使本應存在的方法間的系統誤差不能顯現。

表2 某國家室間質評ALP回報數據分組統計結果

此外，ALP測定時如果不按所用緩沖系統進行分組，而是使用同一靶值，將使室間質評結果混亂，達不到通過參加室間質評來提高參評實驗室檢測準確性的目的。某國家某省在2006年進行的室間質評沒有分組，ALP回報結果見表3，可見在ALP室間質評中，不進行科學合理的方法學分組，必然會導致這種高低相差懸殊的回報結果。

表3 某國家某省2006年室間質評ALP回報結果

4 ALP檢測系統與實驗誤差

試劑盒的性能質量會影響ALP的測定結果，除緩沖液外，其他因素如底物濃度、pH、離子強度、輔因子的種類和濃度等也會影響測定結果。此外，校正方法、儀器性能、儀器分析中的參數設置、儀器維護保養及操作規程等也會對測定結果造成影響，即凡是構成“ALP檢測系統”的各要素在任一環節出現問題都會影響到最終結果。

以某公司生產的ALP試劑盒為例，其緩沖液為2A2M 1P，參數設置為波長405 nm、比色杯光徑1 cm、反應溫度37 ℃。第1種測定方法以血清起動：應用試劑為試劑1與試劑2以4：1比例混合后備用，應用試劑與標本按1000 μL比20 μL的比例混勻，60 s后開始監測2 m in內每分鐘的吸光度變化，并計算出每分鐘吸光度的變化率；第2種測定方法以試劑2起動：試劑1與標本按800 μL比20 μL的比例混勻并保溫3～5 min，加入200μL試劑2混勻，60 s后開始監測2 m in內每分鐘的吸光度變化，并計算出每分鐘吸光度的變化率，根據每分鐘吸光度的變化率計算ALP的活性。從上述過程可以看出，“ALP檢測系統”包含多種影響因素，在分析時需要具體分析和綜合分析相結合。在“ALP檢測系統”間，影響檢測結果的主要因素是緩沖液種類和試劑配方。另一項關于不同檢測系統血清酶測定結果的偏倚評估與可比性的研究發現，檢測系統與目標檢測系統間的誤差不能被接受，其原因也應按上述思路進行分析[8]。

為了做好血清酶測定結果的溯源、校正和室間質評，相關人員應進一步學習IFCC發布的文件[PⅡS0009-9120（98）00039-3]，該文件以實例證明了酶校正物的可交換性只能在有相同分析特異性的方法間進行，并一再強調了“檢測系統”的概念。不能把酶校正物簡單地當作一般代謝物已知濃度的標準品那樣使用，避免造成測定結果和臨床應用的混亂[9]。正如文獻報道的那樣：一個廠家的校正品一般都是在自己的檢測系統內進行評估的，在同類系統內能很好地把測定結果的值在參考方法和常規方法間進行傳遞，但它不一定適合另一個廠家的檢測系統，因此不要把一個廠家針對特定檢測系統生產的校正品用于校正另一個檢測系統[10]。

5 結語

目前，國際上對ALP的基因結構及分子生物學的研究已經非常深入，ALP檢測的參考方法、標準操作程序和參考物質（校正血清）也都已經推廣，ALP測定的準確性也不斷提高。為保證我國臨床常規化驗室ALP活性測定及校正的準確性，實現溯源式管理，應科學開展室間質評，深入開展相關工作。

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Research on the Traceability of the Serum A lkaline Phosphatase Determ ination Results

WANG Wei-bing
Capital M edical University, Beijing 100069, China

An exam ination to the traceability of alkaline phosphatase（ALP）activity discovered that laboratory ALP activity measurement results existed big differences from the fixed value of enzyme reference material, and higher or lower system errors existed between ALP kits from different sources.This review analyzed the reason of these system errors, indicated that the key in fl uencing factor was buffer system type in ALP assay.Taking ALP as an example, it indicated that traceability, calibration and external laboratory quality assessment of serum enzymes activity measurement must consider every element of the detecting system, including performance quality of reagent kit and parameter settings of analyzer.

alkaline phosphatase；biochem ical analyzer；determ ination of the enzyme activity；result traceability；room quality assessment

R197.39

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2015.12.013

1674-1633（2015）12-0049-04

2015-04-08

作者郵箱：wanglei@ccmu.edu.cn