中藥腸愈寧對潰瘍性結(jié)腸炎癌變的干預(yù)作用

徐芳芳馬偉明高志斌康年松

中藥腸愈寧對潰瘍性結(jié)腸炎癌變的干預(yù)作用

徐芳芳1馬偉明1高志斌1康年松2

目的 觀察自擬中藥方腸愈寧預(yù)防、抑制潰瘍性結(jié)腸炎癌變的作用。方法 健康SD大鼠60只，隨機分為空白組、模型組、腸愈寧低、中、高劑量組和美沙拉嗪組，采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（AOM/DSS）化學(xué)誘導(dǎo)方法構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎癌變大鼠模型。空白組不作任何處理。其余各組造模開始第1天開始給藥，連續(xù)9周。觀察大鼠一般情況、大便性狀、體質(zhì)量變化。實驗結(jié)束，解剖觀察大鼠結(jié)腸大體形態(tài)及結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 ①模型組大體形態(tài)符合潰瘍性結(jié)腸炎及癌變表現(xiàn)特點。②各組DAI評分比較：模型組（7.10±0.99）分、腸愈寧低劑量組（3.60±1.89）分、中劑量組（3.30±2.06）分、高劑量組（5.20±2.25）分、美沙拉嗪組（5.60±0.97）分，與空白組（0.50±0.53）分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；腸愈寧低、中、高劑量組、美沙拉嗪組與模型組比較，P＜0.05。③各組結(jié)腸大體形態(tài)評分比較：模型組（4.30±0.95）分、美沙拉嗪組（3.10±0.99）分、腸愈寧低劑量組（2.20±0.63）分、中劑量組（2.80±1.14）分、高劑量組（3.10±1.10）分，與空白組（0.10±0.32）分比較，P＜0.05。腸愈寧低、中、高劑量組、美沙拉嗪組與模型組比較，P＜0.05。④各組結(jié)腸組織學(xué)損傷評分比較：模型組（3.90±0.88）分、腸愈寧中劑量組（3.00±1.89）分、高劑量組（3.40±1.89）分、美沙拉嗪組（3.30±2.06）分，與空白組（0.10±0.32）分比較，P＜0.05。腸愈寧低劑量組（1.70±1.49）分與模型組比較，P＜0.05。結(jié)論 自擬中藥方腸愈寧能明顯減輕潰瘍性結(jié)腸炎癌變大鼠模型的臨床癥狀，改善組織病理類型，減少潰瘍性結(jié)腸炎癌變。

大鼠；潰瘍性結(jié)腸炎；癌變；中藥；氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸鈉

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是臨床難治性疾病之一，其癥狀反復(fù)，遷延難愈。UC及其相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，據(jù)統(tǒng)計，UC相關(guān)性結(jié)腸癌占所有結(jié)腸癌的l%～2%，但是卻占了UC病人死亡原因的15%[1]。UC與結(jié)腸癌之間存在的因果關(guān)系已得到消化界公認(rèn)，因此控制炎癥的發(fā)生、發(fā)展對于腫瘤的防治顯然是有利的[2-4]。筆者采取改良氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（azoxymethane，AOM/ dextran sodium sulfate，DSS）化學(xué)誘導(dǎo)方法構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎癌變大鼠模型，觀察自擬中藥方腸愈寧對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎癌變的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠60只，5周齡，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物合格證號：2007000567215。隨機分成空白組、模型組、美沙拉嗪組、腸愈寧低、中、高劑量組6組，每組10只。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心。22℃±1℃恒溫，50%±10%恒濕飼養(yǎng)，保持光照/黑暗時間，每12h一循環(huán)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 美沙拉嗪緩釋顆粒（商品名：艾迪莎）。自擬中藥方腸愈寧組成：紅藤、蒲公英、敗醬草、馬齒莧各30g，山慈菇15g，蛇六谷10g（先煎），香茶菜30g，炒黃連6g，生地榆30g，槐米、檳榔、炒枳殼、厚樸各10g，炒木香6g，委托浙江省中醫(yī)院制劑中心制備成水煎劑。氧化偶氮甲烷：美國Sigma公司，貨號A5486-100MG。葡聚糖硫酸鈉鹽：MP Biomedicals公司，貨號0216011090，分子量36 000～50 000da。濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032）：批號60882801，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 造模方法 模型組、美沙拉嗪組、腸愈寧低、中、高劑量組先腹腔注射AOM 10mg/kg，濃度為2mg/ mL，1周后開始自由飲用3%DSS溶液，飲用共14天，此為一個循環(huán)，連續(xù)3個循環(huán)。空白組自由飲水進食，不作其他處理。

1.4 給藥方法 腸愈寧低、中、高劑量組和美沙拉嗪組在造模開始第一天即開始灌胃給藥，1天1次，連續(xù)9周。等效劑量以成人常規(guī)劑量按人與大鼠體表面積系數(shù)折算，中藥生藥量為32g/kg。大鼠低、中、高劑量按等效劑量的0.5、1、2倍計算，即16g/kg、32g/ kg、64g/kg，以上均為生藥量。美沙拉嗪緩釋顆粒用量亦取等效劑量，即189mg/kg。空白組和模型組給予等效劑量蒸餾水灌胃。

1.5 取材及組織處理 10周末麻醉處死大鼠，充分暴露腹腔，沿矢狀面縱行剖開，分離肛門至回盲部連接處整段結(jié)腸。用生理鹽水漂洗結(jié)腸組織，觀察全結(jié)腸黏膜的大體形態(tài)。于病變處剪取約1cm長組織條，置于10%多聚甲醛溶液中固定24h。置于包埋盒內(nèi)，流水沖洗4h，然后將標(biāo)本經(jīng)升濃度梯度的乙醇脫水。脫水后，將組織浸入二甲苯溶液中透明，石蠟包埋組織塊。連續(xù)切片，厚度為3μm，裱于載物片上，烘干，備用。

1.6 觀察檢測指標(biāo)

1.6.1 大鼠一般情況及疾病活動度指數(shù) 記錄實驗前后大鼠體質(zhì)量變化值，觀察大鼠進食、飲水、活動、體毛、大便性狀、直腸黏膜脫垂等情況。疾病活動度指數(shù)（disease activity index，DAI）參照Cooper等[5]的評分標(biāo)準(zhǔn)作適當(dāng)修改，見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.2 結(jié)腸大體形態(tài)觀察 觀察結(jié)腸長度、腸壁外觀、血管網(wǎng)絡(luò)清晰度及有無炎癥、潰瘍、瘤樣凸起等。結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分[6]見表2。

1.6.3 光鏡下觀察結(jié)腸黏膜病理形態(tài)學(xué)變化 結(jié)腸黏膜經(jīng)蘇木素-伊紅染色（HE染色）后，作組織學(xué)損傷評分[6]，評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析處理，檢驗資料方差齊性。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示。數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，若方差齊性，采用單因素方差分析，LSD檢驗進行兩兩比較，若方差不齊，采用單因素方差分析Dunnett’s T3檢驗進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

表3 結(jié)腸組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 治療期間各組大鼠無死亡。空白組大鼠食欲良好，飲水適度，反應(yīng)敏捷，大便為顆粒狀，無肉眼血便或脫肛現(xiàn)象。在每一個循環(huán)后，體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時間延長明顯增加。模型組大鼠飲用DSS后出現(xiàn)便次增多、糊狀便，癥狀逐步加重，甚者出現(xiàn)肉眼血便、脫肛，期間大鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、體毛凌亂黯淡，飲水量明顯增多。改為普通飲水后，一般狀態(tài)及大便性狀逐漸恢復(fù)。再次飲用DSS后又表現(xiàn)為腸炎癥狀，恢復(fù)普通飲水后大便性狀恢復(fù)的時間延后。體質(zhì)量增加減緩。腸愈寧低、中、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠第一循環(huán)出現(xiàn)與模型組類似的癥狀，但便血、脫肛的數(shù)量較少，改為普通飲水后大便性狀恢復(fù)的較模型組快。第二、三循環(huán)腸炎表現(xiàn)較模型組輕。

2.2 疾病活動度指數(shù)（DAI） 造模前各組大鼠綜合DAI評分均為0分。實驗?zāi)┨幩来笫笄案鹘MDAI評分見表4。模型組、腸愈寧低、中、高劑量組、美沙拉嗪組，與空白組比較，P＜0.05。腸愈寧低、中、高劑量組、美沙拉嗪組，與模型組比較，P＜0.05。而腸愈寧低、中、高劑量組與美沙拉嗪組之間無明顯差異，P＞0.05。

2.3 結(jié)腸大體形態(tài)評分比較 模型組、美沙拉嗪組、腸愈寧低、中、高劑量組，與空白組比較，P＜0.05。美沙拉嗪組、低、中、高劑量組，與模型組比較，P＜0.05。見表4。

2.4 組織病理學(xué)觀察 各組異型增生數(shù)模型組6只，美沙拉嗪組5只，腸愈寧低劑量組2只，中劑量組4只，高劑量組6只，空白組0只。經(jīng)Fisher精確檢驗，P=0.019，P＜0.05。各組異型增生例數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組結(jié)腸組織學(xué)損傷評分比較，模型組、腸愈寧中、高劑量組、美沙拉嗪組，與空白組比較，P＜0.05。低劑量組與模型組比較，P＜0.05。各組HE染色病理圖片見圖1（封四）。

表4 各組大鼠各項評分比較（分±s）

表4 各組大鼠各項評分比較（分±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；DAI：疾病活動度指數(shù)

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3 討論

AOM/DSS模型是目前使用最廣泛的UC化學(xué)誘導(dǎo)模型[7]。臨床癥狀學(xué)、形態(tài)學(xué)及病理學(xué)觀察證明，該模型與人類潰瘍性結(jié)腸炎癌變過程極為相似。AOM引起鳥嘌呤O6甲基化是誘導(dǎo)基因突變損傷最主要的原因[8]。基因突變使細(xì)胞過度增殖，形成特異性的大腸腫瘤。DSS的致炎機制尚未闡明，可能與DSS的負(fù)電荷影響DNA合成、抑制上皮細(xì)胞增生、破壞腸黏膜屏障、導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能障礙及腸道菌群失調(diào)有關(guān)[9]。從大量文獻數(shù)據(jù)來看，AOM/DSS模型成瘤率與AOM劑量、DSS濃度和老鼠品系相關(guān)，且有明顯的時間依賴性。根據(jù)文獻可見，基于該模型平臺，在實驗第9周時，已出現(xiàn)重度異型增生或癌變，且成瘤率較高，故本研究將造模時間點也定在9周[10-11]。

本實驗中，模型組大鼠在飲用3%DSS的第二天即出現(xiàn)大便性狀改變，逐步出現(xiàn)精神萎靡、飲水增多、體質(zhì)量增長緩慢等情況，從實驗大鼠的這些臨床反應(yīng)可見，該造模方法很好的模擬了人類潰瘍性結(jié)腸炎的臨床狀態(tài)。10周末解剖大鼠，觀察結(jié)腸見明顯炎癥表現(xiàn)：結(jié)腸長度明顯縮短，管壁顏色紫黯，管壁增厚、僵硬、瘀曲，管腔狹窄，黏膜質(zhì)脆易出血，血管增粗、模糊、色黯，部分見潰瘍樣改變。結(jié)腸黏膜局部呈串珠樣瘤樣凸起，周圍黏膜蒼白、干燥。病理切片顯示呈不同程度的異型增生，甚至腺瘤及癌樣改變。

本研究顯示，模型組一般狀態(tài)最差，腹瀉、血便、脫肛嚴(yán)重，其他各組經(jīng)過治療后，一般狀態(tài)相對模型組有改善，腹瀉、血便等癥狀減輕，說明中藥方腸愈寧及西藥美沙拉嗪的治療對UC大鼠臨床癥狀的改善可能有效。低劑量組在DAI評分、結(jié)腸大體形態(tài)評分、結(jié)腸組織學(xué)損傷評分等方面均與模型組有顯著差異，P＜0.05。說明自擬中藥方腸愈寧有改善UC大鼠疾病活動度的作用，減輕炎癥，改善臨床癥狀，并且可減少潰瘍形成、減輕黏膜出血、減少瘤樣組織形成，從而抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜向不典型增生及癌變的轉(zhuǎn)變。

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（收稿：2015-04-10 修回：2015-06-12）

Effect of Chinese Medicine Changyuning on Ulcerative Colitis and Canceration

XU Fangfang1,MA Weiming1, GAO Zhibin1,KANG Niansong2. 1 Yuyao People's Hospital,Yuyao(315400),China;2 Department of Science and Education,Yuyao TCM Hospital,Yuyao(315400),China

Objective To investigate the prevention and treatment effect of TCM Changyuning on ulcerative colitis and canceration.Methods Sixty healthy SD rats were randomized into 6 groups:blank control group,model group,mesalazine group,and Changyuning groups（low,middle,and high doses）,with 10 rats in each group.A zoxymethane（AOM）and dextran sodium sulfate（DSS）were used to establish rat models of ulcerative colitis canceration.Rats in blank control group and model group were given distilled water and the rests were given the corresponding drugs by gavage once a day on the first day of modeling for continuous 9 weeks.General situation, stool,and daily weight of rats were observed and recorded,then at the end of the experiment rats were sacrificed to observe the morphology of colon and the histopathological change of colon by HE staining.Results ①General morphology of the model group conforms to the manifestations of ulcerative colitis and cancaration;②Significant difference in DAI score was found between control group and model,mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（0.50±0.53 vs 7.10±0.99,5.60±0.97,5.20±2.25,3.30±2.06,3.60±1.89,P＜0.05）and between model group and mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（P＜0.05）;③The morphology score was different between blank control group and model,mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（0.10±0.32 vs 4.30±0.95,3.10±0.99,3.10±1.10,2.80±1.14,2.20±0.63,P＜0.05）and between model group and mesalazine,high-,middle-,and low-dose of Changyuning groups（P＜0.05）;④The colon-histopathological score differed between blank control group and model,mesalazine,high-,and middle-dose of Changyuning groups（0.10±0.32 vs 3.90±0.88,3.40±1.89,3.00±1.89,P＜0.05）and between model group and lowdose of Changyuning group（3.90±0.88 vs 1.70±1.49,P＜0.05）.Conclusion Chinese medicine Changyuning can obviously relieve the clinical symptoms of rats with ulcerative colitis and canceration,improve histological change of the colon,and reduce the risk of canceration.

rats;ulcerative colitis;cancaration;Chinese medicine;azoxymethane;dextran sodium sulfate

1浙江省余姚市人民醫(yī)院中醫(yī)科（徐芳芳、馬偉明）、病理科（高志斌）（余姚 315400）；2浙江省余姚市中醫(yī)醫(yī)院科教科（余姚315400）

徐芳芳，Tel：13738590900