液相色譜—串聯質譜法測定動物源性食品中β—受體激動劑的殘留

姜曉野 張超

【摘 要】 本文論述了建立動物源性食品中3種β-受體激動劑（沙丁胺醇，克倫特羅，萊克多巴胺）殘留的檢測方法。結果表明：3種β-受體激動劑在2ng/mL～100ng/mL質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，R2均大于0.996，方法檢出限均小于0.1μg/kg，加標回收率范圍在71.4%～91.6%。該方法相對易操作，重現性好。

【關鍵詞】 β-受體激動劑 固相萃取 同位素 液相色譜-質譜

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2015.11.007

β-受體激動劑俗稱“瘦肉精”，是一類人工合成的藥物。β-受體激動劑最常用的是克倫特羅和沙丁胺醇，因為將其加入畜類飼料中，會減少脂肪的形成，明顯增加瘦肉率[1，2]，因此被長期或屠宰前濫用。β-受體激動劑一經使用會大量在動物的組織中殘留，尤其是肝臟、尿液、肉中含量最高。人食用了高殘留的β-受體激動劑的肉類或肝臟后會引起呼吸、心率加快、胸悶、頭痛、肌肉震顫等中毒癥狀[3]。歐盟、美國和我國都先后立法禁止畜禽生產中食用該類藥物。日本允許將萊克多巴胺使用于動物養殖，但是嚴格制定了最高殘留量[4]。

圖1 β-受體激動劑的化學結構

β-受體激動劑的檢測方法主要有酶聯免疫法[5]、高效液相色譜法[6]、氣質聯用法[7]、液質聯用法[8]、放射免疫法[9]等。每種方法都有優缺點，其中液質聯用法具有定性準確和測定效率高的特點而被廣泛應用。本方法參考了一些文獻中的液質方法，采用了最佳的酶解條件和時間[10]，并改進了一些前處理步驟，提高了工作效率，取得了較好的實驗結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，β-Glucuronidase/aryl sulfatase（>100，000units/mL），Waters MCX SPE固相萃取小柱（60mg-3CC，使用前依次用5%甲醇-氨，甲醇，水，0.1mmol/L高氯酸活化），乙酸銨、異丙醇、氫氧化鈉、氨水均為分析純，超純水，標準物質均購自Dr Ehrenstorfer：鹽酸克倫特羅（98.5%），鹽酸萊克多巴胺（97.0%），沙丁胺醇（99.5%），鹽酸克倫特羅-D9，萊克多巴胺-D6，沙丁胺醇-D3。

1.2 儀器與設備

固相萃取裝置（安捷倫），氮吹儀HSC-12B（天津恒奧），高速冷凍離心機CT15RT（上海天美），1290-6460 液相色譜-三重串聯四極桿質譜儀（安捷倫）。

1.3 儀器參數

（1）色譜條件

色譜柱：Agilent RRHD Eclipse plus C18，2.1mm×50mm，1.8μm，柱溫35℃，進樣體積10μL，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質譜條件

電噴霧離子源，正離子模式（ESI+），檢測模式：多反應監測MRM，毛細管電壓4000V，干燥氣流量10L/min，干燥氣溫度350℃，霧化器壓力35psi。質譜參數見表2。

表2 待測物質譜參數

注：*代表子離子用來做定量分析。

1.4 標準溶液的配制

（1）取沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅標準品，用乙腈配制成1μg/mL混標。

（2）取沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9內標，用乙腈配制為10ng/mL混內標。

（3）將標準品配制成質量濃度分別為5，10，25，40，80，160（ng/mL），內標質量濃度均為5ng/mL的系列工作溶液。

1.5 樣品處理

稱取5.00g樣品，于50mL離心管內，加入濃度均為10ng/mL的三種內標工作液0.25mL，加入0.2moL/L乙酸銨溶液（pH5.2）10.0mL，再加入β-Glucuronidase/aryl sulfatase120μL（近似于2500u/g），渦旋混勻，37℃條件下，酶解6小時。酶解后10000r/min條件下離心10min，上清液轉移至另一離心管中，加入2mL高氯酸，再10000r/min條件下離心10min，上清液轉移至另一離心管中，用12mol/L的NaOH溶液調pH至3-4，再5000r/min，-10℃條件下，離心5min，上清液過活化好的MCX-SPE 60mg-3CC小柱，依次用甲醇、5%甲醇水淋洗，用6mL5%甲醇氨洗脫，15mL離心管收集，氮吹吹干，加0.5mL水復溶，過0.22μm濾膜過濾，上機。

2 結果與分析

2.1 處理，酶解，提取，凈化，色譜條件的選擇

在選擇每克加入2500u的β-Glucuronidase/aryl sulfatase，37℃條件下，酶解6小時。因β-Glucuronidase/aryl sulfatase在pH5.2的條件下活性最佳，因此選用pH5.2的乙酸銨溶液來提取，凈化選了MCX固相萃取小柱，對弱堿性的β-受體激動劑有很強的吸附作用，凈化效果好。乙腈-酸性水流動相系統對目標物有增強離子化效率的作用，采用安捷倫的質譜設備對質譜條件進行了摸索。最后得到了目標物多反應離子監測質譜圖，如圖2所示。

質譜峰的響應強度為縱坐標，待測物的保留時間為橫坐標，在合適的條件下所有的待測物和內標都取得了良好的響應值。

2.2 方法檢出限，標曲線性及回收率

按照1.4中標準曲線的配制方法配制不同濃度的標液，按照1.3中的儀器參數進行分析，質譜峰的響應高度為縱坐標，待測物濃度為橫坐標，分別繪制沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅的曲線，如圖3所示。

圖3 三種β-受體激動劑的曲線線性

從圖3可見，3種β-受體激動劑在5ng/mL～150ng/mL濃度范圍內線性良好，各組分的相關系數R2>0.996。以各目標物在空白樣品中的S/N=3計算方法檢出限，三種β-受體激動劑的檢出限均小于0.1μg/kg，滿足檢測機構的檢測要求。

2.3 方法回收率

在空白樣品中分別加入濃度為10ng/mL、20ng/mL混合標液，混勻后按1.5的方法進行處理，按1.3中的儀器參數對樣品進行分析，二個添加水平的回收率見表3。

表3 三種β-受體激動劑的回收率

由上表可看出，三種β-受體激動劑的回收率在71.4～91.6之間，總體較理想。

3 結論

該方法的前處理利用酶解法，提高了樣品提取效率，用固相萃取去除干擾物質，對目標物進行了有效的提取，摸索出了合理的液相和質譜條件，處理步驟簡單易操作，重現性好，方法回收率較高，靈敏度滿足實驗室檢測要求，適用于食品中β-受體激動劑的檢測。

參考文獻

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作者簡介

姜曉野，工程師，大連工業大學碩士研究生畢業，現就職于撫順市產品質量監督檢驗所食品檢測中心，從事食品檢測工作。

張超，高級工程師，機械設計及制造專業，學士學位，從事實驗室質量管理和質量控制方面的工作。

（責任編輯：張曉明）