外源蛋白在大腸桿菌中高效可溶性表達和胞外分泌策略研究綜述

陳阿娜 葉生梅 孟娜 劉艷

摘 要：采用大腸桿菌作為表達宿主進行蛋白質異源表達的研究逐漸增多，然而實驗過程中存在2個突出問題：（1）可溶性表達量低;（2）胞外分泌能效差。該文系統地綜述了當前的國內外研究現狀，內容涉及外源蛋白在大腸桿菌中高效可溶性表達策略及胞外分泌策略，并對實驗中存在的問題和和研究趨勢提出了見解。部分策略已用于實驗教學并取得了良好的教學效果。

關鍵詞：大腸桿菌;可溶性表達;胞外分泌;研究趨勢

中圖分類號 R394.8文獻標識碼 A ?文章編號 1007-7731（2015）13-25-03

Advances of Soluble and Extracellular Overexpression of Heterologous Proteins in Escherichia coli

Chen Ana et al.

（School of Biochemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Abstract：Heterologous proteins expression in E.coli has been gradually increased in recent years. However，there are two outstanding issues during the experiment（1）low soluble expression level;（2）poor secretion efficiency. This paper systematically reviews the currentresearch status，which relates strategies of soluble expression，extracellular secretion，experimental problems in E.coli，and puts forward opinions of research trends. Some of the strategies have been used in experimental teaching and achieved good teaching results.

Key words：E.coli;Soluble expression;Extracellular secretion;Research trends

采用野生型菌種發酵生產目標蛋白的效率較低，通過基因工程技術進行異源高效表達是降低生產成本的有效途徑。常用的宿主菌為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，也有在畢赤酵母中表達的報道。與其他宿主菌相比，大腸桿菌具有3個顯著優勢：細胞生長快速、分子操作簡單和能在廉價培養基中高密度培養，使其成為科研、生產中最常用的原核表達宿主[1]。但是我們并不回避外源基因在大腸桿菌中表達時存在的2個突出問題：（1）可溶性表達量低;（2）胞外分泌能效差[2]。近年來研究者嘗試了多種策略提高可溶性表達量和分泌效率，研究主要集中在調控發酵過程參數，優化培養基等措施上，對外源蛋白自身改造的研究相對較少。

1 研究現狀

外源蛋白在大腸桿菌中的表達調節是一個包括諸多元素的復雜系統，并非每一種蛋白都能在大腸桿菌中高效表達，部分蛋白無法表達[3]。由于大腸桿菌分泌系統的組成元件復雜、調控精細以及固有的雙層膜結構，因此大腸桿菌表達系統的分泌性能較差[4]。筆者對當前外源蛋白在大腸桿菌中過量可溶性表達策略和高效分泌策略概括如下。內容涉及質粒改造、宿主菌改造、底物蛋白改造、發酵過程參數調控及培養基優化等方面。

1.1 質粒和宿主的有效改造和組合 通過對質粒元件的合理構建，可在轉錄水平和翻譯水平上調節蛋白合成。如在指導學生采用大腸桿菌表達人源化治療性抗體片段時，對pAVEwayTM質粒進行操縱子雙回文結構改造和啟動子替換，使得外源蛋白的表達量顯著提升（數據還未發表）;Olins等從T7噬菌體基因前導序列中鑒定了—9bp的序列g10-L，該序列能使多種基因的表達水平提高40～340倍。若將其置于合成SD序列的上游，按照β-半乳糖苷酶的活性與LacZ mRNA的水平來估計，g10-L序列能使LacZ的翻譯水平提高110倍[5]。大腸桿菌II型分泌系統中蛋白跨外膜分泌主要依靠非特異性滲漏，效率較低，可通過構建外膜滲漏型突變株以提高蛋白胞外分泌水平。如Gumpert等構建了缺少細胞壁和周質空間的L-型菌株用于青霉素G酰基轉移酶、葡萄球菌激酶和微小抗體的制備[6]。Ni等構建了敲除外膜脂蛋白的突變株，使麥芽糖結合蛋白、木聚糖酶和纖維素酶的胞外分泌比例達到總表達量的90%以上[7]。早期的研究多集中在此領域，并且已有和將有許多優良的商業化質粒和宿主可供選用。當前的研究普遍采用“試錯法”，即直接采用商業化的質粒和大腸桿菌變種，構建合適的表達系統。

1.2 優化信號肽 江南大學吳敬團隊研究發現不同的翻譯起始區氨基酸序列和pelB信號肽切割位點的數量會影響外源蛋白翻譯和折疊效率，繼而影響跨膜分泌過程，通過增加信號肽切割位點數量和隨機突變翻譯起始區氨基酸序列，獲得基質分泌能力顯著提升的突變體[8]。亦有研究表明適當增加II型分泌系統信號肽N端帶電區域的正電荷或疏水區域的疏水性有利于提高前體蛋白的分泌效率[9]，但目前并無如何根據指定的目標蛋白選擇合適的信號肽進行分泌表達的通用規則。

1.3 融合表達和共表達分子伴侶 多種融合蛋白，如谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、麥芽糖結合蛋白（MBP）以及硫氧還蛋白（Trx）等均已被證實能成功地表達折疊正確、有生物活性的蛋白，能明顯提高在大腸桿菌細胞質中的可溶性，減少包涵體的形成。分子伴侶是細胞中一大類蛋白質，在細胞內幫助其他蛋白完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構成這些蛋白結構執行功能時的組份。采用分子伴侶在大腸桿菌中進行外源蛋白高效表達成為近年來的研究熱點，如通過共表達鐮狀瘧疾蟲分子伴侶增強了抗瘧疾藥物靶標環化水解酶的表達量[10]。

1.4 共表達或改造轉運蛋白 在大腸桿菌Ⅱ型分泌系統中，外源蛋白通過Sec或Tat途徑進入周質空間，再通過約12～16種蛋白質組成的外膜通道分泌至胞外。然而，由于轉運蛋白的天然表達量低，轉運效率有限，使得外源蛋白在大腸桿菌中分泌效能低。可通過共表達或改造參與跨膜轉運的關鍵性轉運蛋白或輔助蛋白以改善轉運通路進而提高蛋白分泌水平[11]。如Miksch等將大腸桿菌素釋放基因與β-葡聚糖酶共表達時，大腸桿菌的外膜通透性明顯增加，使得大量原本定位在周質空間中的β-葡聚糖酶釋放至胞外培養基中[12]。Sugamata等針對I型分泌系統轉運蛋白HlyB和HlyD進行定向改造，獲得了使枯草芽孢桿菌蛋白酶E胞外分泌量提高27倍的突變體[13]。

1.5 外源蛋白自身的改造 一種簡單的方式是優化蛋白編碼基因密碼子。在實際應用中，可通過全基因合成優化密碼子、穩定mRNA結構[14]。另一種方式是通過蛋白質工程改造既定蛋白。近年來采用蛋白質工程改造目標蛋白，提高其在大腸桿菌中的分泌效率方面取得了一定進展。如杰能科公司2011年將脫支芽孢桿菌普魯蘭酶N端處104個氨基酸截短后，發現截短體比全長蛋白具有更高的胞外分泌能力。專利發明人推測這種現象可能與重組酶分子量的減小有關[15]。最新的研究報道通過在蛋白質N端添加連續的5個天冬氨酸，使得南極假絲酵母脂肪酶B在大腸桿菌中的胞外分泌量達到1.9g/L。添加的5個天冬氨酸使脂肪酶B二聚體的四級結構發生翻轉，新的二聚體結構可能形成某種結構信號肽與GSP（General secretion pathway）上的特定通道蛋白相互識別，促使目標蛋白分泌至胞外[1]。

1.6 發酵過程參數控制和培養基優化 該方式是一種簡單的提高外源蛋白表達量和分泌量的常用策略，因過程和原理相對簡單，使用較為普遍。如陳文波等通過分階段調控發酵過程溫度，使得目標蛋白在大腸桿菌中的表達量和分泌量均有大幅提升[16]。通過添加表面活性劑、滲透劑、金屬離子和甘氨酸等培養基添加劑能夠提高細胞膜的通透性，有助于加強蛋白分泌。如聶堯等通過在發酵后期再培養基中添加0.6%的甘氨酸，可使90%以上的目標蛋白分泌至胞外[17]。此外還可通過優化培養基的營養成分，調控細胞培養的溫度、pH和溶氧等環境參數，獲得有利于細胞生長和蛋白胞外分泌的發酵策略。

2 存在的問題和研究趨勢

綜上所述，在提高大腸桿菌外源蛋白表達及分泌水平研究中，以往焦點主要集中在表達系統和工藝水平上，但是幾乎所有成功案例都具有蛋白特異性。盡管目前在強化大腸桿菌分泌重組蛋白的效能方面取得了一定的進展，但其普遍適用性和有效性并不樂觀，重組蛋白在大腸桿菌中的高效胞外分泌型表達仍然是一個技術難點。通過數據庫對比研究發現，采用完全相同的表達系統和發酵工藝表達不同的外源蛋白時，表達量和分泌效率往往有數量級上的差距。據此推測外源蛋白本身一級氨基酸序列至三級空間結構甚至四級結構也是影響表達水平的重要因素，通過蛋白質工程改造既定蛋白可能是實現高效表達和分泌有效途徑。

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（責編：張長青）