影響電化學免疫傳感器性能因素的研究

邵玲軒　劉源　吳海云　席溫新　戎凱云

摘 要：電化學免疫傳感器具有選擇性好、靈敏度高、檢測速度快等特點，但由于諸多因素影響著它的正常使用和推廣。通過實驗研究發現，電極材料的選擇、修飾方法和固定化技術使用等是影響其性能的主要因素之一。其次，采用的檢測方法，信號的采集電路的設計，數據處理方法對其精度和穩定性也有很大的影響。此外，測試環境參數的設置如待測溶液的pH值、響應時間，激勵信號的選擇，電壓范圍的設置等因素都影響著電化學免疫傳感器的性能。

關鍵詞：免疫傳感器；電化學；影響性能因素

引言

隨著科技的發展，環境污染越來越嚴重，破壞了生態環境。為了實現快速檢測水質中的污染物，以便達到快速治理，常采用電化學免疫傳感器。免疫傳感器具有多樣性、響應時間短，使用壽命長，靈敏度高、可重復使用等特點，適用于便攜式、在線檢測和遠程監控，已在軍事科學，臨床醫學、食品檢測及環境監測方面得到廣闊的應用[1-3]。但是由于電化學免疫傳感器的性能不穩定，使得該類傳感器不能產業化和推廣使用。文章以電流型電化學免疫傳感器檢測水中萘為例，對影響傳感器的性能因素進行了初步探究。

1 電化學免疫傳感器工作原理

電化學免疫傳感器利用抗體和抗原之間的特異性的組合，改變其電化學信號，使敏感元件（抗原/抗體）固定在載體膜上，電極作為轉換元件，傳感器的反應信號通過轉換器，再進行放大和處理并顯示。

2 免疫電極的制備技術直接影響傳感器的性能

免疫電極是電化學免疫傳感器的核心部件，其制備通常包括電極制備和選擇、電極的化學修飾和免疫識別分子的固定等過程。電極材料的選擇、修飾方法和固定化技術的設計、操作步驟、優劣程度、穩定性、合理性與否對降低傳感器的成本，提高傳感器的選擇性、穩定性和靈敏度有直接影響。

2.1 電極的制備

傳感器的電極是敏感元件，它的性能如靈敏度、選擇性受生物大分子包埋方式的影響。常見的方法有：吸附法，包埋法，電化學聚合方法，共價結合法、自組裝法和交聯的方法等。

研究采用三電極系統，工作電極選用鉑電極。工作電極用0.1mm直徑的鉑絲做成半球狀，將其粘接固定在一個塑料環中，然后將其疊合粘接在參比電極上，就構成了三電極微型電解池。在使用鉑電極之前，要用酸堿反復清洗，并在0.025mol/L的氯化鉀溶液中，于0.2-0.6V電壓范圍內，進行循環掃描，直至電流基線穩定為止。

2.2 電極的預處理

實驗的信號源采用型號為CHI660D的電化學工作站。為了保證實驗中工作電極上的電場分布均勻和電極的重復性良好，在電極使用之前用先用蒸餾水沖洗，在用紫外光殺毒處理，最后用氮氣吹干，電極修復前后，電極上的電流電壓圖如圖1所示。

生物識別元件的修飾是免疫傳感器研制的關鍵步驟。修飾后的生物識別分子應保持良好的反應活性，且其活性或親和位點能與目標物結合，并能盡量降低非特異性吸附，從而提高免疫傳感器的信號響應、靈敏度和穩定性。

室溫下，采用電位直測定抗原濃度的方法，把酶標記在免疫傳感器的工作電極上，浸入等濃度梯度的H2O2溶液中，裸金電極作為參比電極，然后均勻的攪拌溶液，等待幾秒之后，便可以測定電壓值，直到記錄下的電壓值達到穩定。由于固定在免疫傳感器上的酶與溶液中對應的酶標抗體分子進行特異性結合，清洗以后，加入HRP氧化雙氧水，由此會產生電信號。而當底物濃度一定時，HRP濃度與電位的差值呈正比，相應的依附在免疫傳感器表面的那部分HRP就會氧化雙氧水，產生與之濃度呈正比的電位差。由于HRP這種標記酶的存在，使得溶液中的抗體濃度與電位差值呈現正比，所以可以根據實驗測得的電位差值判斷所測溶液的濃度，實驗結果如圖2所示。

實驗發現，膜的薄厚、均勻度好壞、重復性、修復技術等直接影響著免疫傳感器的性能。

3 信號采集與處理方式對特性的影響

3.1 采集信號的特點

在電化學傳感器檢測中，有時由于反應機理、溶液濃度等原因，反應產生的電流很小，可達到nA級甚至更小[4]，對微電流的采集，信號調理電路、噪聲處理電路設計及抗外界干擾方法等對傳感器的精度和穩定性影響較大。

3.2 電極系統的選擇

根據待測物質所處系統環境的不同，精度要求不同，可選用兩電極系統、三電極體系和四電極體系。如果確定輔助電極的電極電位在測試過程中不發生變化或者變化可忽略不計時，可選用兩電極體系；當在外激勵信號的作用下，為了克服電極極化和環境波動的影響，可利用一對外電極將激勵電流導入液體，并測量一對內電極上的電壓，采用四電極系統。它主要采用的是交流阻抗法，測試電阻；在三電極體系中，由于電流不通過參比電極，使得輔助電極和工作電極之間的電壓比兩電極體系中工作電極和參比電極之間的電壓更穩定，所以三電極體系是最通常的選擇。

3.3 采集系統影響性能因素

3.3.1 恒電位電路對傳感器特性的影響

在三電極系統中，恒電位電路的設計精度是保障系統檢測精度的主要因素之一。在氧化還原反應的過程中，由于工作電極反應物質濃度的下降，系統穩定性發生了改變，會影響系統測量。采用恒電勢電路，使用三個電極電位閉環負反饋調節系統保持在一個穩定的狀態，消除由于反應時間和電極電位的影響，它解決了因反應造成外部激勵信號值偏離以及溶液電阻Ru的存在是造成控制誤差，保障檢測結果的準確性。恒電位儀是各種三電極式（工作電極、輔助電極、參比電極）電化學傳感器的接口，主要將外部激勵信號近乎準確地施加于傳感器上，驅動樣品溶液發生電化學反應，并對產生的響應信號做相應的預處理（信號轉換、放大、濾波）[5-6]。目前多選用全差分型的恒電位儀芯片。

3.3.2 信號處理電路設計對傳感器特性的影響

信號處理多采用高階低通濾波器電路、噪聲處理電路和放大電路，I/V轉換的作用是將電流信號轉換為電壓信號的裝置；低通濾波器電路是將高頻干擾信號去除，而電壓信號的干擾輸出穩定，AD轉換器最好選用精度高，抗干擾能力強的芯片。

4 測試環境參數的設置對傳感器性能的影響

4.1 pH值對輸出電流的影響

溶液的pH值對免疫傳感器電位響應有顯著的影響。在其他保持不變的情況下，實驗研究了pH 5.5-8.5的PBS溶液對免疫傳感器電流響應是有影響的，如表1所示。

當pH在5.5～7.4范圍，氧化峰電流飛速減小至最小值；在pH在7.4-8.5內，pH逐漸增大，伴隨著峰電流的逐步增大。當pH=7.4時，抗原抗體結合產生的復合物緊緊地附著在免疫傳感器的電極層面上，這樣才導致電流值降到最小值。

4.2 測試時間對電流/電壓的影響

圖3所示的是在相同濃度下，分別在不同氧化還原反應時間（馬上測、4分鐘、10分鐘、16分鐘、19分鐘和22分鐘），對應的電壓值和電流值的變化。從圖中可以看出，任何一個待測濃度溶液，在外加激勵信號后，應放在13-16分鐘，待進行充分的氧化還原反應后，再測試，才能保證測試的準確性。

4.3 掃描速度對傳感器性能的影響

在配置的溶液中選取濃度為0.5×10-3mol/L的溶液五組，改變儀器的掃描速度，以0.05V/s為步長，0.05V/s為初始掃描速度，實驗數據如表2所示。

顯然從表2可以直觀的看出，隨著儀器掃描速度的增加，正負峰的峰值電流的差值逐漸增大，那是因為掃描速度小，那么實驗過程中受溶液中的離子的擴散傳遞的影響就越小，從而使電流正負峰的偏移就越小，這也就更加能反映這個化學反應的實質，即實驗所得的結果更加準確，但是掃描速度并不是越小越好，因為這不但會影響實驗所需的時間，更重要的是會造成電極的自我腐蝕，破壞電極，造成電極的極化現象，這會嚴重影響實驗的準確性，因此建議在實驗過程中將掃描速度控制在0.08V/s-0.12V/s之間，這就能保證儀器的正常使用且得到的實驗數據準確性較高，也就能使該傳感器處于一個較好的靈敏度。

此外，選擇不同種類的激勵信號，對傳感器的測試結果也有較大的影響。再者，還有激勵信號的電壓范圍的設置，需要通過試驗進行選擇，否則會影響測試結果。還有水環境中存在復雜多變的基質，會嚴重干擾免疫分析的準確性和穩定性。

參考文獻

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[2]Zhao L F， Li S G， He J， et al. Enzyme-free electrochemicalimmunosensor configured with Au-Pd nanocrystals and N-doped graphene sheets for sensitive detection of AFP[J].Biosensors and Bioelectronics，2013，49：222-225.

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[5]鐘海軍，鄧少平.恒電位儀研究現狀及基于恒電位儀的電化學檢測系統的應用[J].分析儀器，2009，2：1-5.

[6]姚毓升，解永平，文濤.三電極電化學傳感器的恒電位儀設計[J].儀表技術與傳感器，2009（9）：3-6.

作者簡介：邵玲軒（1994-），女，學生，從事生物傳感器及智能儀器方向的研究。

*通訊作者：劉源（1964-），女，教授，從事生物傳感器及智能儀器方向的研究。