軟骨細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白膠植入修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果研究

張桂友　林宇雨　楊戈　聶建雄　譚享業(yè)　賈春媛　許朋　黃菊蘭

【摘要】 目的：觀察軟骨細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白膠植入修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。方法：用硫酸銨沉淀法從兔血液中提取纖維蛋白并且制備纖維蛋白膠；建立兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，編號，將40只新西蘭兔分為實(shí)驗組及空白對照組，實(shí)驗組植入復(fù)合物，空白對照組不進(jìn)行任何植入處理。分別于術(shù)后4、8、12周取材料，進(jìn)行大體、甲苯胺藍(lán)以及組織學(xué)的觀察，判斷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞缺損的修復(fù)情況。結(jié)果：實(shí)驗組實(shí)驗12周時可以修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨的缺失，以透明的軟骨組織為主，修復(fù)效果明顯優(yōu)于空白對照組。結(jié)論：軟骨細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白可以很好地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的缺損，可以考慮用于再生修復(fù)軟骨的缺損。

【關(guān)鍵詞】 纖維蛋白膠； 軟骨缺損； 硫酸銨沉淀

【Abstract】 Objective：To observe the effect of the compound fibrin glue on repairing articular cartilage defect of rabbit.Method：The fibrin was extracted from rabbit blood by ammonium sulfate precipitation method and prepared fibrin glue.The defect model of rabbit articular cartilage was established，then numbered.The 40 New Zealand rabbits were divided into the experimental group and the blank control group，the experimental group was implanted composite，the blank control group without any implant treatment.The materials were taken respectively after 4，8，12 weeks，underwent the generally，toluidine blue staining and histological observation，the repair of articular cartilage defect was judged.Result：In the experimental group，the defect of the articular cartilage was repaired at 12 weeks，and the tissue of the cartilage was transparent，and the effect of the repair was better than that of the blank control group.Conclusion：Chondrocytes complex fibrin can be a good repair for articular cartilage defects，can be considered for the regeneration of cartilage defects.

【Key words】 Fibrin glue； Cartilage defects； Ammonium sulfate precipitation

First-authors address： Zhongshan Sanxiang Hospital， Zhongshan 528463， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.006

、

關(guān)節(jié)軟骨缺損主要是由機(jī)械外傷或者炎癥等原因造成，據(jù)研究數(shù)據(jù)顯示關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床發(fā)生率大概為5%左右[1]。早在1968年Chestenman等[2]已經(jīng)報道采用軟骨細(xì)胞來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。為了能夠使得植入的細(xì)胞很好地固定于關(guān)節(jié)軟骨缺損處，需要一個比較合乎要求的移植載體。傳統(tǒng)的載體選擇一般都為商品化的人纖維蛋白膠，但是在美國考慮疾病的傳播而被限制使用。硫酸銨沉淀法是比較簡便的一種制備纖維蛋白原的方法，并且可以避免疾病傳播。筆者在查閱相關(guān)文獻(xiàn)時發(fā)現(xiàn)目前采用該方法制備纖維蛋白膠修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的報道較少，因此決定采用自體的軟骨細(xì)胞符合纖維蛋白修復(fù)兔關(guān)節(jié)缺損，并收到比較理想實(shí)驗結(jié)果，現(xiàn)將實(shí)驗整理作如下報道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料 凝血酶原購自杭州康恩貝公司，氯化鈣以及枸櫞酸鈉為分析純，40只新西蘭兔購自上海醫(yī)藥工業(yè)研究所，體重范圍2～3 kg，雌雄部分，隨機(jī)分為實(shí)驗組以及空白對照組，其余的藥品參考綦惠等[3]報道中所用試劑。

1.2 方法

1.2.1 自體軟骨細(xì)胞的分析和培養(yǎng) 對實(shí)驗組的兔子進(jìn)行編號，采用3%的異戊巴比妥經(jīng)耳緣進(jìn)行麻醉，在無菌的條件下削取右側(cè)股骨滑車的關(guān)節(jié)軟骨。

1.2.2 制備生物膠原蛋白 用A、B兩種液體混合而成。凝血酶、Ca2+為A液主要成分，其中含有400 IU/mL的凝血酶和40 mmol/L的Ca2+。纖維蛋白、XⅢ因子是B液主要成分，含有60 g/L的纖維蛋白原以及30 U/mL的XⅢ因子。軟骨細(xì)胞和纖維蛋白復(fù)合參考文獻(xiàn)[4]的報道。

1.2.3 分離軟骨細(xì)胞 取實(shí)驗兔的膝關(guān)節(jié)股骨髁軟骨組織。將其剪成塊狀，PBS沖洗，剪碎，離心，加入2% Ⅱ型膠原酶溶液，然后37 ℃、5% CO飽和溶液培育3 h，然后800 r/min，離心5 min，收集離心后的細(xì)胞、再用PBS沖洗3次。

1.2.4 模型制備 將大兔仰臥于手術(shù)臺，3%的異戊巴比妥經(jīng)耳緣進(jìn)行麻醉，切口在膝外側(cè)，在股骨外側(cè)的髁關(guān)節(jié)面進(jìn)行抽取軟骨，直徑為3 mm缺損做在關(guān)節(jié)平面，縱向鉆入3 mm，直達(dá)骨髓腔。

1.2.5 分組 將已經(jīng)編號的40只大兔分為實(shí)驗組和對照組。實(shí)驗組兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)植入含有軟骨細(xì)胞和纖維蛋白復(fù)合物，空白對照組不做任何植入處理。分別在第4、8、12周進(jìn)行處死取材，用10%體積分?jǐn)?shù)的甲醛固定，30%甲酸脫鈣，石蠟進(jìn)行包埋然后制備成4 μm的切片。

1.3 觀察項目 蘇木精-伊紅染色和大體實(shí)驗觀察修復(fù)組織學(xué)的效果，用甲苯胺藍(lán)染色觀察修復(fù)后透明軟骨形成情況。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗觀察情況 所用實(shí)驗兔膝關(guān)節(jié)活動正常，關(guān)節(jié)無粘連現(xiàn)象、沒有發(fā)現(xiàn)滑膜增生和關(guān)節(jié)游離，顯示關(guān)節(jié)液清亮。實(shí)驗組4～8周，半透明、軟骨樣組織替代缺損，并且邊界模糊，表面光滑。對照組4～8周發(fā)現(xiàn)色澤比較灰暗，表面出現(xiàn)凹凸不平，在12周時出現(xiàn)蟲蝕樣，創(chuàng)面邊界模糊不清。

2.2 組織學(xué)結(jié)果 造模12周后用蘇木精-伊紅對兩組切片進(jìn)行染色，結(jié)果實(shí)驗組修復(fù)的組織透明，軟骨厚度接近正常，與周圍軟骨結(jié)合較完好，有梭型纖維樣的細(xì)胞在表層出現(xiàn)，軟骨有陷窩，深層的軟骨已經(jīng)出現(xiàn)鈣化和底層的軟骨緊密結(jié)合。對照組缺損的軟骨部位只生成少量纖維組織，經(jīng)過修復(fù)的地方比較薄。

2.3 甲苯胺藍(lán)染色情況 造模12周后對兩組切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。實(shí)驗組染色為陽性，缺損處于周圍正常組織界限不清晰?？瞻讓φ战M切片的甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果為陰性。

3 討論

如何找到合適的載體為修復(fù)的主要任務(wù)。理想的載體應(yīng)該具備以下幾個優(yōu)點(diǎn)：（1）與宿主細(xì)胞有良好相容性；（2）有理想三維結(jié)構(gòu)；（3）具有良好可塑性，可以將其制備成所需形狀；（4）有生物降解性質(zhì)[5-7]。傳統(tǒng)的載體選擇一般都為商品化的人纖維蛋白膠，但是在美國因為考慮疾病的傳播而被限制使用。硫酸銨沉淀法是比較簡便的一種制備纖維蛋白原的方法，并且可以避免疾病傳播。在本次的使用中發(fā)現(xiàn)其具有較理想的實(shí)用性。

在本次的研究中，來自本身的軟骨細(xì)胞和生物蛋白膠復(fù)合，對于軟骨損傷的修復(fù)有理想的效果，明顯優(yōu)于對照組。但是在蘇木精-伊紅和甲苯胺藍(lán)的顏色中顯示，以纖維軟骨為主的修復(fù)，所以不能完全替代原來透明軟骨的功能。在甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果中，缺損的細(xì)胞還具有相關(guān)活性。有數(shù)據(jù)報道，自體軟骨細(xì)胞在移植過程中細(xì)胞可以不用擴(kuò)散而達(dá)到和體外擴(kuò)增相當(dāng)?shù)男迯?fù)效果[8]。

近年來也有報道使用自體軟骨細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)缺損并取得良好效果的報道[9-10]。從本次試驗結(jié)果來看，運(yùn)用自體軟骨組織病理病理切片等均顯示修復(fù)效果良好。因此筆者認(rèn)為，軟骨細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白可以很好地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的缺損，可以考慮用于再生修復(fù)軟骨的缺損。

參考文獻(xiàn)

[1]李欽宗，信金黨.關(guān)節(jié)鏡下微骨折術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究進(jìn)展[J].中國內(nèi)鏡雜志，2015，21（2）：166-170.

[2] Chesterman P J， Smith A U. Homotrasplantation of articular cartilage and isolated chondrocytes. An experimental study in rabbits[J]. J Bone Joint Surg Br，1968，50（1）：184-197.

[3]綦惠，孫磊，陳磊，等.脫鈣骨基質(zhì)與生物蛋白膠復(fù)合載體修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（25）：4589-4593.

[4]傅捷，吳海山，周維江，等.軟骨細(xì)胞纖維蛋白膠混合物修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21（7）：673-675.

[5] Vinater C， Mrugala D， Jorgensen C， et al. Cartilge engineering： a crucial combination of cells， biomaterials and biofactors[J]. Trends Biotechnol，2009，27（5）：307-314.

[6]王秋玲，呂玉明.組織工程修復(fù)骨及軟骨缺損的現(xiàn)狀及展望[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（37）：7358-7362.

[7]王德芳，喬廣艷，劉莉.軟骨細(xì)胞與復(fù)合水凝膠的生物相容性研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報，2012，3（11）：1465-1466.

[8]傅捷，董肇陽，祝云利，等.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及表皮細(xì)胞生長因子對其影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21（7）：677-679.

[9]王秋玲，呂玉明.組織工程修復(fù)骨及軟骨缺損的現(xiàn)狀及展望[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（37）：7358-7362.

[10]胡志俊，胡波，唐德志，等.兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)特征[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2012，14（46）：8555-8556.

（收稿日期：2015-06-30） （本文編輯：王宇）