基于熵權(quán)-AHP法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)方黃芪方絮凝工藝

趙馨雨，趙穎，鄧?yán)蚶颍瑒⒂窬辏佑遥瑓乔?/p>

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

中藥提取液的除雜純化工藝是制備中藥制劑的重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)水提醇沉法存在生產(chǎn)周期長、有效成分損失多等不足[1]，已不能滿足當(dāng)今中藥的質(zhì)量要求[2]。絮凝純化技術(shù)利用絮凝劑與中藥提取液中的雜質(zhì)結(jié)合生成絮凝團(tuán)，經(jīng)沉降分離以除去雜質(zhì)[3]，避免了高濃度乙醇對有效成分溶解度的影響[4]，有利于有效成分的保留。本實驗研究的復(fù)方黃芪方由黃芪、山楂等藥味組成，具有輔助治療高脂血癥的功效[5]。其水提液中山楂含有的黃酮類成分具有調(diào)血脂作用[6]；黃芪為方中君藥，黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)脂肪代謝的藥理作用[7]，兩者為主要藥效成分；同時，水提液中還含有蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、纖維素等雜質(zhì)成分，此類成分導(dǎo)致水提液渾濁、不穩(wěn)定及服用量增加等問題[8]。絮凝法在去除雜質(zhì)、藥液澄清度及穩(wěn)定性和有效成分保留率方面具有明顯的優(yōu)勢[4]。因此，研究絮凝純化工藝的重要參數(shù)對中藥制劑生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。

中藥水提液中大部分的雜質(zhì)成分含量與藥液的物理參數(shù)密切相關(guān)。有研究認(rèn)為，中藥水提液的黏度反映了藥液中淀粉、果膠、黏液質(zhì)等高分子物質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)等帶電膠體粒子的數(shù)量與電導(dǎo)率成正比[9]；藥液pH 的變化可能會造成溶液中非水溶性成分轉(zhuǎn)為游離沉淀，影響相關(guān)成分的存在狀態(tài)[10]；濁度值是衡量水溶液中懸浮物、膠體等不溶性物質(zhì)的量化指標(biāo)，也是表征中藥水提液澄清度的指標(biāo)[11]。但是，目前研究多以1種或多種有效成分含量為藥液純化效果的評價指標(biāo)[12]，而不能全面地分析藥液純化前后的變化。故本實驗以提取液為研究對象，通過黏度、濁度等理化參數(shù)結(jié)合成分含量測定，系統(tǒng)評價不同純化方法對其純化效果的影響，以期為中藥提取純化建立一套新型評價模式。

在中藥復(fù)方制備工藝研究中，多種檢測指標(biāo)的綜合評價是優(yōu)化工藝參數(shù)的重要方式[13]，各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)的確定是進(jìn)行評價的關(guān)鍵[14]。采用層次分析法（AHP）賦權(quán)與客觀熵權(quán)法進(jìn)行綜合加權(quán)，既符合中藥復(fù)方君臣佐使的理論配伍規(guī)律，又體現(xiàn)了各指標(biāo)間的實際影響，與Box-Behnken 響應(yīng)面法相結(jié)合，建立復(fù)方黃芪方絮凝工藝的優(yōu)化方法，為科學(xué)合理確定絮凝條件提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色譜儀、Ultimate 可變波長檢測器（美國賽默飛科技有限公司）；e2695 型高效液相色譜儀、2424 型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Waters 公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵（上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司）；BS 110S 型電子分析天平（北京賽多利斯公司）；旋轉(zhuǎn)黏度計（美國Brookfield 儀器有限公司）；PB-10 型pH 計（德國賽多利斯公司）；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（北京科委永興儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品黃芪甲苷（批號：110781-201717，純度：96.9%）、蘆丁（批號：100080-201811，純度：91.7%）均購于中國食品藥品檢定研究院；殼聚糖、羧甲基殼聚糖（上海源葉生物有限公司）；101 果汁澄清劑（安徽陸榮生物技術(shù)有限公司）；海藻酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；冰醋酸（西隴化工股份有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜級（美國Sigma 公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

黃芪（批號：20180909）、山楂（批號：20180510）、炒萊菔子（批號：20180415）均購于北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1 復(fù)方黃芪方水提液的制備與絮凝純化處理

按參考文獻(xiàn)［5］的工藝以處方比例稱取黃芪、山楂等藥味共90 g，加12 倍量水煎煮3 次，每次1 h，濾過，減壓濃縮后制備復(fù)方黃芪方水提液。精密移取不同濃度水提液100 mL 于燒杯中，按照不同絮凝工藝條件進(jìn)行絮凝反應(yīng)，攪拌10 min 后取出，靜置24 h，4000 r·min-1離心20 min（離心半徑為16 cm），濾過分離上清液，備用。

2.2 絮凝劑的制備

精密稱取殼聚糖1.0 g，取冰醋酸1 mL 加水定容至100 mL 量瓶中；分別精密稱取羧甲基殼聚糖1.0 g、101 果汁澄清劑5.0 g、海藻酸鈉0.1 g，加水定容至100 mL 量瓶中，超聲混勻后靜置24 h，制成相應(yīng)的絮凝劑溶液。

2.3 有效成分黃芪甲苷與總黃酮保留率的測定

對絮凝后上清液中黃芪甲苷含量、總黃酮含量及絮凝處理前水提液中黃芪甲苷含量、總黃酮含量進(jìn)行測定[5]，按照公式（1）計算復(fù)方黃芪方藥液中黃芪甲苷、總黃酮的保留率。

2.4 不同絮凝劑的考察

2.4.1 上清液理化參數(shù)的測定 取絮凝后上清液各20 mL 于干燥至質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量并計算出膏率。再取絮凝后上清液各20 mL，在25 ℃下測定濁度值、電導(dǎo)率、pH，并于60 r·min-1轉(zhuǎn)速下，測定樣品黏度值。

2.4.2 絮凝劑的選擇 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及前期預(yù)實驗，采用殼聚糖、羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉、101果汁澄清劑為絮凝劑[11,15]，絮凝條件設(shè)置為溫度30 ℃、攪拌速度為400 r·min-1、2 g·L-1的絮凝劑加入量、攪拌10 min，按2.1 項下進(jìn)行絮凝操作，取上清液按2.4.1 項下方法進(jìn)行有效成分含量、出膏量、pH、黏度、濁度、電導(dǎo)率的測定與計算。

2.5 單因素考察

以藥液中黃芪甲苷保留率、總黃酮保留率、上清液出膏率為指標(biāo)，考察絮凝溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，藥液質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 g·mL-1，殼聚糖加入量分別為0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 g·L-1，攪拌速度分別為300、400、500、600、700、800 r·min-1對水提液絮凝效果的影響。

2.6 綜合評分指標(biāo)權(quán)重的確定

2.6.1 熵權(quán)法確定權(quán)重系數(shù) 將第i個實驗的j個評價指標(biāo)數(shù)據(jù)利用離差標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立評價指標(biāo)矩陣Xij。按公式（2）計算指標(biāo)信息熵值（Hi）；按公式（3）計算各指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)（wj）[16]。

式中，Pij為第i個實驗的j個評價指標(biāo)的概率。

2.6.2 AHP法確定權(quán)重系數(shù) 根據(jù)本方中功效成分含量與絮凝工藝要求，確定各指標(biāo)的優(yōu)先順序：黃芪甲苷保留率=總黃酮保留率＞出膏率，并計算得到各指標(biāo)權(quán)重[17]。

2.6.3 熵權(quán)法-AHP 確定權(quán)重 按公式（4）、（5）計算復(fù)合權(quán)重系數(shù)（w復(fù)合）與綜合評分[18]。

式中，Aj為AHP的權(quán)重值。

2.7 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗

選取攪拌速度（A）、殼聚糖加入量（B）、藥液質(zhì)量濃度（C）為3 個考察因素，根據(jù)Box-Behnken的試驗設(shè)計原理，以有效成分黃芪甲苷保留率、總黃酮保留率、出膏率的綜合評分為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗[19]，因素與水平見表1。

表1 復(fù)方黃芪方水提液絮凝工藝的響應(yīng)面分析因素及水平

2.8 最佳工藝驗證

采用Design-Expert 11 軟件分析，得到復(fù)方黃芪方水提液的最佳絮凝工藝，以優(yōu)選出的工藝條件進(jìn)行驗證實驗，平行操作3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 絮凝劑的選擇

4 種絮凝劑對復(fù)方黃芪方水提液絮凝的影響見表2。由表2 可知，在化學(xué)指標(biāo)結(jié)果中，殼聚糖的出膏率最低為30.69%，而果汁澄清劑的出膏率最高；除海藻酸鈉外，其余絮凝劑的有效成分保留率均在80%以上；果汁澄清劑、殼聚糖的黃芪甲苷損失最少，其保留率分別為81.24%、78.43%。在物理指標(biāo)結(jié)果中，水提液和絮凝處理后上清液的pH為4.3～4.5，說明絮凝劑在純化過程中pH 無明顯改變；未處理的水提液黏度最大，殼聚糖絮凝處理后呈現(xiàn)出較小黏度，其余絮凝劑絮凝后的黏度均為100～115 mPa·s；絮凝后藥液濁度的順序為殼聚糖＞羧甲基殼聚糖＞果汁澄清劑＞海藻酸鈉；除殼聚糖外，絮凝后藥液的電導(dǎo)率相較于未處理藥液均有所增加。

表2 復(fù)方黃芪方不同種類絮凝劑對水提液絮凝的結(jié)果（n=2）

因此，以物理指標(biāo)結(jié)合化學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)殼聚糖絮凝后上清液黏度、電導(dǎo)率、濁度明顯降低，說明純化后澄清度好并且有效除去了藥液中果膠、蛋白質(zhì)、懸浮物等多種類型的雜質(zhì)；并且藥液的出膏率有所下降，也減少了有效成分的損失。因此，確定選用殼聚糖作為絮凝劑純化水提液。

3.2 單因素試驗結(jié)果

中藥水提液的絮凝除雜過程復(fù)雜，絮凝劑與藥液的結(jié)合狀態(tài)對絮體的形成和純化效果有顯著影響，殼聚糖加入量、藥液質(zhì)量濃度、攪拌速度、絮凝溫度對水提液絮凝效果的影響見圖1～4。

圖1 復(fù)方黃芪方殼聚糖加入量對水提液絮凝效果的影響

圖1 顯示，隨著殼聚糖用量的增多，出膏率有所降低，這是由于殼聚糖分子氨基離子化呈正電性，將與藥液中負(fù)電荷的膠粒發(fā)生中和作用[2]，隨著殼聚糖用量的增多，與膠粒中和的正電荷增加導(dǎo)致更多的膠粒穩(wěn)定性降低，進(jìn)而通過絮凝反應(yīng)除去更多雜質(zhì)顆粒；當(dāng)絮凝劑加入量＞3 g·L-1時，黃芪甲苷與總黃酮的損失明顯增加。因此，初步確定3 g·L-1的殼聚糖加入量為宜。

由圖2可知，藥液質(zhì)量濃度為0.10～1.00 g·mL-1時，各指標(biāo)隨藥液質(zhì)量濃度的增加均有不同程度的下降，這一趨勢的主要原因可能是提取液質(zhì)量濃度越低，雜質(zhì)顆粒越分散，與絮凝劑結(jié)合也更充分，除雜效果較好。但稀釋質(zhì)量濃度至0.05 g·mL-1時，顆粒之間距離過大，絮凝劑與其碰撞概率下降，吸附架橋作用減弱，從而導(dǎo)致出膏率偏高。因此，藥液質(zhì)量濃度為0.10～0.25 g·mL-1適宜。

圖2 復(fù)方黃芪方藥液質(zhì)量濃度對水提液絮凝效果的影響

由圖3 可知，攪拌速度對黃芪甲苷與總黃酮保留率的影響較大，這可能是由于攪拌可以增加水提液與絮凝劑的動能，使殼聚糖分子的分散度及殼聚糖與藥液之間的接觸增加，從而產(chǎn)生較大的絮體，但是同時也產(chǎn)生了一定的剪切力，可能使結(jié)合物再次分離并懸浮在溶液中，進(jìn)而影響整體絮凝效果。當(dāng)攪拌速度＞600 r·min-1時，黃芪甲苷保留率大幅下降，因此，攪拌速度不宜＞600 r·min-1。

圖3 復(fù)方黃芪方攪拌速度對水提液絮凝效果的影響

由圖4 可知，20～40 ℃對絮凝效果影響并不明顯，但隨著絮凝溫度升高到50 ℃時有效成分黃芪甲苷的損失較大。因此，在20～30 ℃下進(jìn)行純化即可。

圖4 復(fù)方黃芪方絮凝溫度對水提液絮凝效果的影響

3.3 復(fù)合權(quán)重結(jié)果

本實驗將AHP 和熵權(quán)法得到黃芪甲苷保留率、總黃酮保留率、出膏率3 個指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行綜合加權(quán)，計算得到各指標(biāo)的wj，分別為黃芪甲苷保留率0.25、總黃酮保留率0.34、出膏率0.41；主觀權(quán)重值（Aj）結(jié)果見表3。按照2.6.3 項下方法計算各指標(biāo)的復(fù)合權(quán)重系數(shù)，分別為黃芪甲苷保留率（w1）0.34、總黃酮保留率（w2）0.47、出膏率（w3）0.19。

表3 AHP的指標(biāo)成對比較的判斷矩陣結(jié)果

3.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表4，復(fù)方黃芪方水提液絮凝效果響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果見表5，三因素間響應(yīng)面交互作用見圖5。

表5 復(fù)方黃芪方水提液絮凝工藝響應(yīng)面方差分析結(jié)果

圖5 復(fù)方黃芪方攪拌速度、殼聚糖加入量和藥液質(zhì)量濃度間相互作用3D圖

采用Design-Expert 11 軟件對表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到出膏率、黃芪甲苷保留率、總黃酮保留率的綜合評分（Y）對A、B、C 的回歸方程：Y=-127.76+0.42A+40.36B+330.24C +0.011AB-0.29AC+2.85BC-0.000 46A2-5.85B2-617.47C2（r=0.918 8）。由表5 可見，回歸模型是顯著的（P=0.004 5＜0.01），可用于響應(yīng)值預(yù)測；失擬項差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明此二次回歸方程擬合度良好。各因素對絮凝過程的影響程度依次為B＞A＞C；其中B 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；A、C、B2、C2差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明此3 個因素對水提液的絮凝純化工藝均有影響。

觀察響應(yīng)面圖的坡度，可以直觀判斷2 個自變量對響應(yīng)值的交互作用程度，即坡度越陡，說明自變量的影響越大。從圖5 可以看出，B 與A、C 的交互作用明顯，而A 與C 兩者交互效應(yīng)相對不明顯。此外，3 個影響因素對絮凝效果綜合評分的影響均有先增大后減小的趨勢，推測可能由于殼聚糖加入量的增加及攪拌速度的加快，使殼聚糖與藥液接觸更加充分，絮凝反應(yīng)的發(fā)生明顯增加，但過量殼聚糖則不利于絮凝反應(yīng)發(fā)生，而且攪拌速度過快會導(dǎo)致形成的絮體破碎；隨著藥液質(zhì)量濃度增加，溶液變濃稠，進(jìn)而影響了雜質(zhì)顆粒的運動以及絮體的積聚。

3.5 最佳工藝驗證

通過Box-Behnken設(shè)計模型的最優(yōu)條件分析，得出絮凝純化工藝參數(shù)：A 361.81 r·min-1、B 4.16 g·L-1、C 0.20 g·mL-1。考慮到實際操作，調(diào)整絮凝純化工藝條件為A 360 r·min-1、B 4.00 g·L-1、C 0.20 g·mL-1，綜合評分預(yù)測值為68.22。在此條件下，驗證結(jié)果見表6，綜合評分分別為70.93、72.41、71.89，與預(yù)測值的相對誤差為1.86%，表明模型的預(yù)測性好，說明響應(yīng)面法優(yōu)化的殼聚糖絮凝工藝參數(shù)穩(wěn)定可行。

表6 復(fù)方黃芪方水提液最佳絮凝工藝驗證結(jié)果

4 結(jié)論

本研究利用單因素分析、熵權(quán)-AHP結(jié)合響應(yīng)面法建立復(fù)方黃芪方水提液的絮凝工藝，最佳純化水提液的絮凝工藝參數(shù)：攪拌速度360 r·min-1、絮凝劑加入量4.00 g·L-1、藥液質(zhì)量濃度0.20 g·mL-1。純化得到的復(fù)方黃芪方藥液澄清度好、黃芪甲苷保留率為（85.86±1.40）%、總黃酮保留率為（71.52±0.82）%、出膏率為（29.16±0.25）%。相比純化前出膏率明顯降低，并且有效保留了水提液中的有效成分，可為絮凝工藝的方法研究提供參考。

本實驗首次以有效成分保留率、出膏率為化學(xué)指標(biāo)，pH、黏度、濁度、電導(dǎo)率為物理指標(biāo)，對不同絮凝劑的絮凝除雜效果進(jìn)行全面比較，篩選出殼聚糖為合適的絮凝劑，并對其絮凝餐參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。此外，殼聚糖屬于天然來源的高分子絮凝劑，具有無毒、可生物降解的特點[20]，可為進(jìn)一步研究環(huán)境友好型材料與技術(shù)在中藥純化領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。