鴨胚大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的分離鑒定與藥敏分析

王苗利 陳靜 李玉杰 徐鴻 曹振山

摘 ?要：2015年4月，濱州市無(wú)棣縣某鴨場(chǎng)最近出現(xiàn)鴨胚孵化率下降，死胚率達(dá)到30%。實(shí)驗(yàn)室對(duì)送檢的3枚鴨胚進(jìn)行了細(xì)菌分離、生化鑒定及藥敏分析。通過(guò)對(duì)鴨胚的細(xì)菌分離純化，得到兩種細(xì)菌，均為革蘭氏陰性桿菌;通過(guò)對(duì)兩種細(xì)菌生化鑒定，結(jié)果為大腸桿菌和肺炎克雷伯菌;對(duì)兩種菌進(jìn)行藥敏分析，根據(jù)藥敏結(jié)果對(duì)鴨場(chǎng)進(jìn)行科學(xué)用藥，降低濫用藥、過(guò)度用藥對(duì)鴨場(chǎng)帶來(lái)的危害。

關(guān)鍵詞：鴨胚;細(xì)菌分離;生化鑒定;藥敏分析;大腸桿菌;肺炎克雷伯菌

中圖分類號(hào)：S858.325.1 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? 文章編號(hào)：1673-1085（2015）06-0010-03

大腸桿菌病是養(yǎng)鴨場(chǎng)最常見的細(xì)菌病之一。大腸桿菌既可以水平傳播，也可以垂直傳播，主要引起鴨的卵黃吸收不全、心包炎、氣囊炎、肝周炎[1]，本菌由于很容易產(chǎn)生耐藥性，實(shí)際生產(chǎn)中感染途徑及感染原因不一，臨床治療越來(lái)越復(fù)雜。

肺炎克雷伯菌廣泛分布于自然界，該菌近年來(lái)成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌[2-4]，主要存在于人和動(dòng)物腸道、呼吸道、泌尿生殖道。肺炎克雷伯菌可在全身各部位發(fā)生感染，但最高的發(fā)病率在尿路和呼吸道。

近年來(lái)，禽病感染發(fā)病原因越來(lái)越復(fù)雜，混合感染越來(lái)越常見，再加上抗生素的濫用，細(xì)菌的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)，給臨床診斷帶來(lái)了很大的困難。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室診斷以及科學(xué)的藥敏分析，合理的指導(dǎo)用藥治療，成為今后發(fā)展的趨勢(shì)，相信如果廣大養(yǎng)殖用戶都能科學(xué)、合理的用藥，一定會(huì)改善抗生素濫用、細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的現(xiàn)象，減少抗生素給禽以及人類帶來(lái)的危害，更好地應(yīng)對(duì)禽場(chǎng)的疫病防控。

1 ?發(fā)病情況

2015年4月份，濱州市無(wú)棣縣某鴨場(chǎng)最近出現(xiàn)了鴨胚在孵化過(guò)程中死亡情況，經(jīng)過(guò)了解，場(chǎng)內(nèi)種鴨正常，無(wú)明顯癥狀，之前受精卵、孵化率均正常，大約28日出殼;但最近一批鴨胚孵化至24d落盤后，至第26天開始出現(xiàn)死胚。實(shí)驗(yàn)室接到場(chǎng)主送檢的樣本后，立即開展檢驗(yàn)，并根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)用藥，得到了良好效果。

2 ?試驗(yàn)材料與方法

2.1 ?試驗(yàn)材料 ?科馬嘉顯色培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂，革蘭氏染色液，奧林巴斯顯微鏡，梅里埃生化及藥敏儀VITEC2。

2.2 ?試驗(yàn)方法

2.2.1 ?病料接種 ?無(wú)菌操作，將鴨胚表面用酒精和碘酊消毒;從蛋殼氣室一端敲一小孔，用無(wú)菌棉棒伸入蛋內(nèi)至卵黃，沾取病料接種于顯色培養(yǎng)基上，接種完后將平皿倒置放于溫箱中，37℃培養(yǎng)18～24h。

2.2.2 ?細(xì)菌染色鏡檢及分離純化 ?挑取顯色平板上培養(yǎng)出的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，染色步驟為：結(jié)晶紫溶液染色1.5min后，清水洗凈;革蘭氏碘液酶染1.5min后，清水洗凈;酒精脫色40s后，清水洗凈;最后用復(fù)紅溶液染色20s后，清水洗凈。將玻片自然晾干，在目標(biāo)區(qū)域滴加松柏油，100倍油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

結(jié)合鏡檢結(jié)果及培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌顏色、形態(tài)的不同，挑取單菌落，三線劃線法純化到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板倒置放于溫箱中，37℃培養(yǎng)18～24h。

2.2.3 ?細(xì)菌鑒定及藥敏分析 ?將純化的營(yíng)養(yǎng)平板取出，置于超凈臺(tái)內(nèi)，根據(jù)染色鏡檢結(jié)果，選擇合適的鑒定、藥敏卡片;無(wú)菌操作，分別挑取單菌落接種于3ml 0.45%氯化鈉溶液中，菌懸液濃度控制在0.5～0.63Mc濃度，備裝鑒定卡片;濃度調(diào)好后，無(wú)菌吸取250μl菌懸液于新的3ml 0.45%氯化鈉溶液中，備裝藥敏卡片;將鑒定卡片和藥敏卡片分別插入制備好的菌懸液中，做好標(biāo)記，裝載上機(jī)，5～18h后讀取結(jié)果。

3 ?結(jié)果與分析

3.1 ?病料接種培養(yǎng)結(jié)果 ?經(jīng)過(guò)溫箱37℃培養(yǎng)18～24h后，取出平板，觀察到平板上長(zhǎng)出兩種細(xì)菌，分別為紫紅色和藍(lán)色的菌落。

3.2 ?細(xì)菌染色鏡檢結(jié)果 ?經(jīng)過(guò)革蘭氏染色，確定平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌為兩種，均為革蘭氏陰性桿菌。

3.3 ?細(xì)菌生化鑒定及藥敏分析 ?生化鑒定結(jié)果見表1、表2，根據(jù)鏡檢結(jié)果，選擇GN革蘭氏陰性桿菌鑒定卡片和GN13革蘭氏陰性桿菌藥敏卡片，制備菌懸液并上機(jī);經(jīng)過(guò)鑒定和藥敏分析，鑒定結(jié)果為大腸桿菌和肺炎克雷伯菌，藥敏結(jié)果見表3、表4。

由表1可知，生化結(jié)果符合大腸桿菌生化譜，置信度極好的鑒定結(jié)果，符合率為99%;由表2可知，生化結(jié)果符合肺炎克雷伯菌生化譜，置信度極好的鑒定結(jié)果，符合率為98%;由表3可知，此大腸桿菌首選藥依次為厄他培南、慶大霉素、妥布霉素，由表4可知，此肺炎克雷伯菌首選藥依次為環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、厄他培南、慶大霉素。

4 ?討論

結(jié)合此次藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，以及考慮較小的血藥濃度，建議此鴨場(chǎng)選擇慶大霉素治療，血藥濃度控制在1μg/ml，防止濫用藥、過(guò)度用藥，造成微生物生態(tài)失衡、耐藥菌株的增加的現(xiàn)象。

另外，大腸桿菌、肺炎克雷伯菌是常見的傳染性病原菌，建議養(yǎng)殖場(chǎng)在日常中注意生物安全的科學(xué)管理，舍內(nèi)、舍外定期消毒，減少病原菌的繁殖;及時(shí)清理病死禽及糞便，并做無(wú)害化處理;定期對(duì)場(chǎng)內(nèi)鼠類等動(dòng)物進(jìn)行滅殺;減少外來(lái)獸醫(yī)等人員帶來(lái)的感染風(fēng)險(xiǎn);減少與場(chǎng)外禽類的接觸風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?宋修慶.鴨場(chǎng)大腸桿菌病的危害與防治[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2011（10）：30-31.

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[3] ?Craven DE.What is healthcarc-associated pneumonia，and how should it be treated？[J].Curr Opin Infect Dis，2006，19（2）：153-160.

[4] ?Gupta A.I lospital-acquired infections in the neonatal intensive care unit-Klebsiella pneumonia[J].Semin Pcrinatol，2002，26（5）：340-345.