銅綠金龜子腸道鏈霉菌Streptomyces sp. BCa1菌體的抗菌成分研究

郭志凱　劉壽柏　馬帥　王蓉

摘 要 為從昆蟲來源的放線菌次級代謝產物中尋找藥物先導分子，對銅綠金龜子幼蟲腸道鏈霉菌Streptomyces sp. BCa1菌絲體化學成分進行了研究。通過活性跟蹤，從其菌絲體的氯仿甲醇萃取物中分離得到主要成分1。利用高分辨質譜、一維和二維核磁波譜技術，將該主要成分1鑒定為具有雙重旋轉對稱結構的不飽和大環內酯類抗生素阿扎霉素（elaiophylin），具有顯著的抗金黃色葡萄球菌活性。該類化合物為首次從昆蟲來源的放線菌中發現。

關鍵詞 銅綠金龜子；鏈霉菌；菌體；阿扎霉素；抗菌活性

中圖分類號 O629.9 文獻標識碼 A

Abstract In order to find drug leads from insect-associated actinomycetes，guided by antibacterial activity assay，a major bioactive constituent 1 was isolated from the organic solvent（chloroform and methanol mixture）extract of the mycelia of the cockchafer（Anomala corpulenta Motsch）-derived Streptomyces sp. BCa1. The compound was identified as elaiophylin（1）， a symmetrical macrolide antibiotic with 16-membered unsaturated dilactone ring，on the basis of spectroscopic analyses including HR-ESI-MS，1D and 2D NMR experiments. Compound 1 showed significant antibacterial activity against Staphylococcus aureus. This kind of compound was firstly reported from an insect-derived Streptomyces.

Key words Anomala corpulenta Motsch； Streptomyces sp.； Mycelia； Elaiophylin； Antibacterial activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.020

與昆蟲共生等特殊生境生活著次生代謝途徑特殊的微生物[1-2]，已成為藥物先導化合物發現的重要來源。昆蟲來源的放線菌和真菌能產生結構新穎的活性成分如抗真菌物質dentigerumycin[3]、mycangimycin[4-5]、sceliphrolactam[6]、resistomycin和tetracenomycin[7]，以及骨架新穎的倍半萜類的抗細菌成分[8]，昆蟲共生菌正成為尋找結構獨特、活性多樣性天然藥物分子的重要材料。作者曾從中華稻蝗腸道共生放線菌Amycolatopsis sp. HCa1的發酵液中發現了多個具有強抗腫瘤細胞活性的新型苯并蒽醌類化合物[9-10]并從其菌體中發現了具有免疫抑制活性的新型糖脂類化合物[11-12]。在持續篩選昆蟲來源的微生物產活性成分研究中，從一株銅綠金龜子（Anomala corpulenta Motsch）幼蟲腸道鏈霉菌Streptomyces sp. BCa1的發酵液中分離鑒定了Hsp90蛋白抑制劑格爾德霉素（geldanamycin）和萘醌型大環內酯類化合物hygrocin A及其類似物[13]。為充分挖掘銅綠金龜子腸道鏈霉菌Streptomyces sp. BCa1產結構新穎性活性分子的潛力，本研究對該菌菌體活性成分進行了分離，從其氯仿甲醇提取物中分離純化得到化合物1，通過波譜解析以及與文獻對照鑒定為具有雙重旋轉對稱結構的不飽和大環內酯類抗生素阿扎霉素（elaiophylin）（圖1）。該化合物對革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）具有顯著的體外抑制活性，但對革蘭氏陰性菌-煙草青枯菌（Pseudomonas solanacearum）及白色念珠菌（Candida albicans）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4）等真菌無抑制活性。該化合物為首次從昆蟲來源的放線菌中發現。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 由Agilent 6210 TOF LC-MS質譜儀（Agilent，美國）測定高分辨質譜（HR-ESI-MS）數據；化合物的一維和二維數據由布魯克核磁共振波譜儀（Bruker DRX 500 MHz，德國）測定，以TMS為內標，化學位移以δ（ppm）表示；薄層層析硅膠（GF254）和層析柱硅膠（200～300目）均購自青島海洋化工廠；Sephadex LH-20和ODS反相硅膠分別購自瑞典Pharmacia Biotech和日本京都Nacalai Tesque公司；分離實驗中使用的試劑均為重蒸后的工業用試劑。

1.1.2 菌株 放線菌Streptomyces sp. BCa1菌株為先前作者從銅綠金龜子幼蟲腸道中分離所得[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的發酵 Streptomyces sp. BCa1菌株經高氏I號培養基平板（1.0 g/L KNO3，0.5 g/L MgSO4，

0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L NaCl，0.01 g/L FeSO4·7H2O，20 g/L可溶性淀粉，20 g/L 瓊脂）活化，28 ℃培養 4 d，之后接種于液體高氏I號培養基中，于柜式搖床120 r/min，28 ℃ 培養3 d作為種子液。取30 mL種子液接種至裝有400 mL液體麥芽培養基（20 g/L麥芽提取物，20 g/L蔗糖，1 g/L蛋白胨）的Erlenmeyer燒瓶（1 000 mL）中，共接種20瓶，于三層搖床上發酵12 d（120 r/min，28 ℃）。

1.2.2 化合物的分離和純化 將發酵物過濾后得發酵液和菌體，菌體經等體積混合的氯仿-甲醇溶劑（3 L）于室溫下浸提7 d，超聲萃取3遍（3 L×3），合并萃取液后減壓濃縮得黃色粗提物6.9 g。該粗提物經減壓硅膠柱色譜，以CHCl3-MeOH梯度洗脫得7個流份（v/v 100 ∶ 0，100 ∶ 1，100 ∶ 2，100 ∶ 4，

100 ∶ 8，100 ∶ 16，0 ∶ 100），經抗金黃色葡萄球活性測試發現其中第5個流份（CHCl3-MeOH，100 ∶ 8）具有強烈的抑菌活性。該流份（242.6 mg）經ODS反相柱層析，以MeOH-H2O（v/v 40 ∶ 60，50 ∶ 50，60 ∶ 40，

70 ∶ 30，80 ∶ 20，100 ∶ 0）梯度洗脫得到6個流份，其中第3個流份（MeOH-H2O，60 ∶ 40）經Sephadex LH-20凝膠柱層析（甲醇為流動相）得到化合物1（24.5 mg）。

1.2.3 抗菌活性測試 體外測試抗菌活性所采用的方法與先前報道的文獻一致[14]。供試菌株有金黃色葡萄球菌，煙草青枯菌，白色念珠菌和尖孢鐮刀菌。

2 結果與分析

化合物1，正源高分辨電噴霧質譜顯示其準分子離子峰為m/z 1047.5859[M+Na]+，推出其分子式為C54H88O18，不飽和度為11。化合物1的13C-NMR譜僅給出了27個碳信號峰，故判斷該化合物存在對稱結構。結合其1H-NMR和DEPT135譜可以看出該化合物的27個碳信號峰分別為2個季碳、6個甲基、3個亞甲基和16個次甲基（其中8個連氧次甲基）信號峰。其中，δC 167.1的季碳顯示該分子中有酯羰基存在；δC 144.8，144.8，130.6和121.3的次甲基碳提示分子中的一半結構上含有2個雙鍵；δC 99.2-64.9之間的碳提示該分子中含有糖環，且位于糖環上的δC 99.2和92.5的碳提示這2個碳上均可能連有2個氧；通過HMQC譜可判斷該化合物中碳上所連接的質子情況。

分析該化合物的1H-1H COSY譜（圖2）相關信號可進一步推斷并揭示該分子部分結構片段：H-3與H-2和H-4存在相關，H-5與H-4和H-6存在相關，H-6與H-7和H-17存在相關，H-13與H-12和H-14存在相關，H-15與H-14和H-16存在相關，H-20與H-14和H-21存在相關，H-23與H-24和H-22存在相關，H-25與H-24和H-26存在相關，H-26與H-27，以及H-8與H-18，H-10與H-19，H-9與OH-9，H-25與OH-25存在相關。進一步分析HMBC譜（圖2）相關信號可揭示半個分子的結構：H-3與C-1，H-18與C-7和C-9，H-19與C-9和C-11，OH-11與C-10、C-11和C-12以及H-22與C-13和C-26存在相關。H-7與C-1的關鍵HMBC相關信號證實了該分子由兩個上述推斷出的半分子結構通過1位羧基與7位上的羥基成酯環合。上述結構片段連接整理即可得到化合物1的平面結構。該化合物的相對構型通過ROESY實驗（圖3）得到確定：H-2與H-4，H-5與H-3和H-7，H-7與H-17、H-8和OH-9，OH-11與OH-9、H-19和H-13，H-14與H-13和H-15均存在NOE相關，從而確定了化合物1的相對構型。

依據HMQC、HMBC 和1H-1H COSY實驗結果，將該化合物的1H和13C-NMR數據歸屬如下：1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δ 6.82（1H，dd，J =15.3，11.3 Hz，H-3），6.11（1H，dd，J=14.9，11.3 Hz，H-4），5.70（1H，d，J=15.3 Hz，H-2），5.65（1H，dd，J=14.9，10.1 Hz，H-5），5.42（s，11-OH），5.09（1H，d，J=10.4 Hz，H-7），4.91（1H，br s，H-22），4.51（d，J=5.9 Hz，24-OH），4.48（d，J=6.9 Hz，

9-OH），4.27（d，J=4.6 Hz，25-OH），3.79（1H，m，overlap，H-13），3.77（1H，m，overlap，H-26），3.75（1H，m，overlap，H-9），3.73（1H，m，overlap，H-15），3.72（1H，m，overlap，H-24），3.38（1H，m，overlap，H-25），2.48（1H，m，H-6），2.27（1H，brd，J=8.4 Hz，H-12a），0.95（1H，m，overlap，H-12b），1.82（1H，m，H-8），1.79（1H，m，H-23a），1.39（1H，m，H-23b），1.59（1H，m，H-20a），1.36（1H，m，H-20b），1.57（1H，m，H-10），1.08（3H，d，J=6.4 Hz，H-27），1.06（1H，m，overlap，H-14），1.05（3H，d，J=6.1 Hz，H-16），0.97（3H，d，J=6.4 Hz，H-17），0.86（3H，d，J=6.9 Hz，H-19），0.79（3H，d，overlap，J=6.8 Hz，H-18），0.79（3H，d，overlap，J=7.7 Hz，H-21）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）：δ 167.1 （s，C-1），144.8（d，C-3和C-5），130.6（d，C-4），121.3（d，C-2），99.2（s，C-11），92.5（d，C-22），75.8（d，C-7），70.3（d，C-25），69.4（d，C-9），68.4 （d，C-13），66.4（d，C-15），65.8（d，C-26），64.9（d，C-24），48.0（d，C-14），42.9（d，C-10），41.1（d，C-6），36.6（t，C-12），36.3（d，C-8），32.7（t，C-23），19.2（q，C-16），18.8（t，C-20），17.1（q，C-27），15.5（q，C-17），9.5（q，C-21），8.8（q，C-18），6.9 （q，C-19）。上述數據與文獻譜學數據[15]比對一致，確定化合物1為阿扎霉素（elaiophylin）。該化合物屬于大環內酯類抗生素，為具有雙重旋轉對稱結構的不飽和十六元環內酯，其化學結構新穎，體外抗金黃色葡萄球菌活性實驗發現，其在濃度為25 μg/mL時抑菌直徑為17 mm，同樣濃度的陽性對照（硫酸鏈霉素）抑菌直徑為23.1 mm。

3 討論與結論

當前廣泛應用的抗生素約70%由各種放線菌所產生，而昆蟲來源的放線菌則在天然抗生素分子發現中未經廣泛研究。本研究中，前期對昆蟲金龜子幼蟲腸道放線菌Streptomyces sp. BCa1的菌體粗提物進行抗金黃色葡萄球菌活性發現，其具有顯著的抗金黃色葡萄球菌活性，結果從該粗提物中分離鑒定了其主要活性成分為阿扎霉素B，它是一種具有雙重旋轉對稱結構的不飽和大環內酯類抗生素，均由鏈霉菌產生[16]。此前對該金龜子幼蟲腸道放線菌的發酵液成分分析發現其次生代謝產物與Streptomyces hygroscopicus的相同[13]，而且Streptomyces hygroscopicus菌體中也發現有阿扎霉素B[15，17]，進一步從化學本質上證實金龜子幼蟲腸道放線菌Streptomyces sp. BCa1為Streptomyces hygroscopicus。阿扎霉素B具有獨特的化學結構和特有的生物活性，已引起了生物學家和化學家的廣泛興趣。本研究中發現阿扎霉素B對革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌具有顯著的抗菌活性，但對革蘭氏陰性的農業病原細菌煙草青枯菌，香蕉枯萎病原真菌尖孢鐮刀菌4號生理小種以及人體病原真菌白色念珠菌等無抗菌活性。龔雨梅等[17]也發現阿扎霉素B具有顯著的抗金黃色葡萄球菌活性，而且其結構類似物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、萬古霉素抗性腸球菌等革蘭氏陽性致病菌具有顯著的抑菌活性，但對革蘭氏陰性菌和真菌無抑制活性[18]。此外阿扎霉素B還具有細胞毒活性[19]、海蝦幼蟲致死活性[20]。更令人感興趣的是它還具有治療家畜線蟲感染的作用[16]，但在農業線蟲病害上還未見研究。在后續工作中，將對該放線菌及其自然或人工突變菌株的發酵產物進行殺熱帶作物病原線蟲活性研究，希望篩選發現阿扎霉素B及其結構類似物具有殺農業病原線蟲活性，進而利用該放線菌或其產物用于線蟲病害防治。

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