葉子花屬植物的組織培養研究進展

陳影 曹武 曾宋君

摘 ?要 ?葉子花屬植物的組織培養是其種苗繁殖最有效的手段之一，同時，還能為其性狀改良提供有效的遺傳轉化系統。從葉子花組織培養外植體的選擇、基本培養基類型、植物生長調節物質的選擇和組培苗的移栽等方面綜述了葉子花組織培養的研究現狀，并詳細介紹了葉子花組織培養的再生方式和影響因素，最后，探討了葉子花組織培養研究中存在的問題以及未來的研究和發展方向。

關鍵詞 ?葉子花;組織培養;外植體;培養基;植物生長調節劑

中圖分類號 ?S685.99 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Tissue Culture Advances of Bougainvillea

CHEN Ying1，2， CAO Wu2， ZENG Songjun1*

1 Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement，

South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou， Guangdong 510650， China

2 Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou， Guangdong 510225， China

Abstract ?Tissue culture is one of the most effective means of rapid propagation of Bougainvillea， which also can provide an effective genetic transformation system for character improvement. This paper summarized the advances of Bougainvillea tissue culture， including explant types， basic medium， plant growth regulators， and introduced the regeneration methods and influence factors of Bougainvillea tissue culture. In addition， main problems in Bougainvillea tissue culture were analyzed， the research and development direction in the future was also discussed.

Key words ?Bougainvillea;Tissue culture; Explants;Medium;Plant growth regulator

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.029

葉子花 （Bougainvillea）又稱三角梅、三角花、九重葛、勒杜鵑、簕杜鵑、寶巾、寶荊等，紫茉莉科葉子花屬常綠藤本植物。該屬植物約有14～18個種，300多個品種，原產于南美巴西附近的沿海島嶼。中國引種栽培的葉子花有3個原生種、1個自然雜交種和100多個品種。3個原生種為葉子花（B. glabra Choisy）、毛葉子花（B. spectabilis Willd）和秘魯葉子花（B. peruviana Bonpl.），自然雜交種為葉子花和秘魯葉子花雜交的布蒂娜葉子花（B. x buttiana Holttum & Standl）[1-4]。由于葉子花品種豐富，生命力強，栽培適應范圍廣，且花色豐富、花期長，是應用廣泛的園林綠化植物和盆栽花卉[5-6]，此外，它還含有對人類健康以及環境保護有積極作用的化學物質，如天然色素和黃酮等[7-13]。葉子花是贊比亞的國花，也是中國海南省海口、三亞，廣東省深圳、惠州、江門、中山、 珠海，福建省廈門、三明、惠安，廣西壯族自治區北海、梧州，云南德宏、臨倉、宜良，貴州黔西南，浙江洞頭和臺灣省屏東等18市的市花[2]。葉子花屬植物，特別是栽培品種在我國栽培時極難結實，其常規繁殖常采用扦插，有時采用嫁接和壓條，但葉子花的常規繁殖增殖系數較小、生根時間較長、繁殖時間受季節限制等不利因素的影響[14-19]，而對于一些數量稀少的新品種及一些扦插繁殖生根難的品種，采用傳統的扦插繁殖方法繁殖難以在短時間內獲得大量種苗滿足市場需求。而組織培養快速繁殖技術能夠在短期內獲得基因型一致的大量的優質苗木，并能保持母株的優良特性且防止品種退化，同時種苗生產不受季節的限制，是一種有效的苗木規模化的繁殖方式。另外，建立葉子花的植株再生體系，還能為其性狀改良提供有效的遺傳轉化系統。全世界對葉子花屬植物的組織培養已進行了較多的研究[20-44]，本文對這些文獻進行綜述， 以期為以后葉子花屬植物組織培養的研究和生產應用提供有價值的參考。

1 ?組織培養的品種及外植體的選擇

1.1 ?組織培養概況

葉子花組織培養研究的最早報道是1978年Chaturvedi等[21]和1981年Sharma等[24]以莖尖為外植體，成功地對葉子花品種B. glabra ‘Magnifica進行了不定芽的誘導和生根培養并移栽到大田獲得與親本性狀一致的正常開花的植株。中國最早關于葉子花組織培養的報道是 1983年譚文澄[37]利用葉子花的側芽進行的。在全世界能檢索到的24篇有關葉子花屬植物的組織培養中，有關葉子花（B. glabra）的論文10篇，有關毛葉子花（B. spectabilis）的論文9篇，有關布蒂娜葉子花（B. x buttiana）的論文1篇，以及同時進行2個或以上品種的論文4篇[20-44]。Duhoky和Al-Mizory[22]的研究結果表明，雜交種布蒂娜葉子花的組織培養比原生種葉子花和毛葉子花要容易得多，無論是愈傷組織的誘導、不定芽的分化還是生根都表現出較大的優勢。布蒂娜葉子花在最適愈傷誘導培養基WPM[45]+2.0 mg/L BA（6-芐氨基腺嘌呤）+0.2 mg/L NAA（萘乙酸）上的誘導率為92.86%，葉子花和毛葉子花為71%和82.4%;而它們的器官發生率分別為96.43%、78.57%和89.29%。程治英[27]以葉子花4個品種的帶腋芽的未木質化的莖段為外植體進行不定芽的誘導時，也發現雜交種（Red and White）比原生種葉子花和毛葉子花更易進行組織培養。而張小紅等[42]發現紅色葉子花和紫色葉子花最適的芽誘導和增殖培養基不同，紫色品種的最適培養基為MS+1.0 mg/L BA+0.4 mg/L NAA，紅色品種的最適培養基為MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA。

1.2 ?外植體的選擇和滅菌

目前，已報道葉子花組織培養中所采用的外植體主要有莖尖、莖段、側芽、葉片、花器官等，其中最常用的是莖尖和莖段。外植體滅菌最常采用的方法是75%的酒精浸泡30～60 s，無菌水沖洗3～5次后，再用0.1%的 HgCl2溶液浸泡8～12 min，最后用無菌水沖洗5～8次。周俊輝等[43]為了提高外植體滅菌的成功率，將帶健壯腋芽的半木質化枝條剪成4～5 cm的小段后先用1%的洗衣粉水浸泡30 min，流水沖洗后，再用100 mg/L的慶大霉素溶液浸泡30 min再進行常規消毒。孫利娜等[36]對葉子花（B. glabra）的不同外植體消毒和愈傷組織誘導進行了較為系統的研究。他們選擇生長健壯無病蟲害的葉子花的花、苞片、莖尖、葉片、葉柄、幼嫩莖段、半木質化莖段作為外植體，采用75%的酒精滅菌25～35 s，再用0.1%升汞消毒7～11 min。消毒效果由好到劣的外植體依次為半木質化莖段>幼嫩莖段>葉柄>葉片>苞葉、花、頂芽。其中苞葉、花、頂芽未成功獲得既未污染又成活的外植體。其它4種外植體中，最佳消毒方法為先用濃度75%酒精溶液滅菌30 s，無菌水沖洗5次后，再用0.1%升汞溶液消毒9 min，最后用無菌水沖洗7～8次;同時，他們研究發現而不同外植體具有不同的愈傷組織誘導能力，其中最佳外植體為半木質化莖段，它在最佳的愈傷組織誘導培養基MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培養基上，愈傷組織的誘導率達90.6%，而幼嫩莖段、葉片、葉柄分別為75%、62.5%、12.5%。葉頂英和張健[39]在對葉子花的莖尖、莖節和葉片進行不定芽的誘導時發現，它們的再生能力表現為莖尖>莖節>葉片。杜天奎和徐青[29]以莖尖和莖節為外植體進行不定芽的誘導和增殖時，發現毛葉子花莖尖的最佳誘導和增殖培養基為MS+2.0 mg/L BA+0.5 mg/L NAA，而莖節的最佳誘導和增殖培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA（吲哚丁酸）。

2 ?基本培養基及生長調節物質選擇

2.1 ?基本培養基

葉子花組織培養研究中最常采用的基本培養基是MS[46]、1/2 MS和1/4 MS（其中1/2 MS和1/4 MS多用于生根培養），也有采用WPM和B5[47]等作為基本培養基的報道[22，30]。Duhoky和AL-Mizory[22]對布蒂娜葉子花、葉子花和毛葉子花的愈傷組織誘導、器官發生和生根在以WPM和MS為基本培養基的組織培養情況進行了研究，布蒂娜葉子花、毛葉子花在WPM培養基上比在MS培養基上的愈傷組織誘導、器官發生方面均表現出較好的效果，葉子花的器官發生同樣表現出較好的效果，但愈傷組織誘導率差異不大。而在生根培養方面，除布蒂娜葉子花在1/4 WPM和1/4 MS上的生根率均為100%外，其它2個種類及蒂娜葉子花在1/2 WPM培養基和1/4 WPM上比在1/2 MS培養基和1/4 MS上均表現出較好的效果。龔偉等[30]報道葉子花莖段愈傷組織的誘導和分化效果在MS培養上比在1/2 MS和B5培養上好。

2.2 ?生長調節物質選擇

在葉子花的組織培養中，常用的植物生長調節劑有BA，2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），IAA（吲哚乙酸），IBA和NAA。KT和2，4，5-三氯苯氧基乙酸也曾被用于葉子花的組織培養中。Chaturved等[21]和Sharma等[24]報道在改良的MS培養中加入KT（激動素）時，不能誘導不定芽的產生，僅在高濃度時產生愈傷組織;而在培養基中加入2，4，5-三氯苯氧基乙酸有利于葉子花的生根。

2.2.1 ?愈傷組織的誘導和分化 ? 葉子花的組織培養目前多采用叢生芽繁殖。但葉子花在組織培養過程中，外植體基部常會產生愈傷組織，多被切除丟棄而未進行增殖和分化出芽實驗。有關葉子花愈傷組織的誘導論文只有3篇，而利用愈傷組織分化出苗只有龔偉等[30]進行了報道，其研究表明，光葉子花（B. glabra）莖段在MS+3.0 mg/L BA+0.2 mg/L 2，4-D+mg/L NAA 0.1培養基的培養效果取好，愈傷組織的誘導率和分化率分別達78.2%和25.6%。孫利娜等[36]對葉子花（B. glabra）的不同外植體消毒和愈傷組織誘導進行了較為系統的研究。發現6-BA在葉子花的愈傷組織誘導中起著非常重要的作用，濃度為0.5～2.0 mg/L均可誘導出愈傷，比2，4-D的效果更好，在培養基中添加NAA時具有一定的促進作用。杜天奎和徐青[29]報道毛葉子花葉片愈傷組織的最佳誘導培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D。

2.2.2 ?不定芽誘導增殖培養 ? ?葉子花不定芽的誘導增殖有時會使用同一種培養基，有時會有所差別。MS或改良的MS培養中附加BA是最常見的，大多數的情況下還會附加NAA、IAA或IBA。BA和NAA、IAA或IBA的濃度范圍從0.2 mg/L至2.0 mg/L。Chaturvedi等[21]報道，葉子花的最佳誘導培養基為改良的MS+0.2 mg/L BA+1.0 mg/L IAA，而最佳的增殖培養基為改良的MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/L NAA。譚文澄[37]報道，葉子花不定芽的最佳誘導培養基為改良的MS+2.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+5 000 mg/L水解乳蛋白，而最佳的增殖培養基為改良的MS+1.0 mg/L BA+1.5 mg/L IAA+10 mg/L 腺嘌呤+10 mg/L硫銨素。Javed等[23]報道毛葉子花最佳誘導培養基為改良的MS+0.25 mg/L BA+0.25 mg/L NAA，最佳的增殖培養基為改良的MS+2.0 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+250 mg/L谷氨酸。周俊輝[43]報道毛葉子花最佳誘導培養基為MS+0.2 mg/L BA+1.0 mg/L IAA，而最佳的增殖培養基為MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/L NAA。在不定芽誘導和增殖采用的同一種培養基的研究中張波等[41]報道葉子花的最佳誘導和增殖培養為MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，不定芽的增殖倍數可達到12;郭海濱等[31]報道葉子花最佳誘導和增殖培養為MS+0.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA;李師翁等[34]報道毛葉子花的最佳誘導和增殖培養為MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA。

2.2.3 ?生根培養 ? 葉子花的生根率較低，在生根過程中有時會伴隨愈傷組織的產生。而不同的葉子花品種的生根培養基不同。葉子花生根實驗中培養中常使用的生長調節物質有IBA、NAA和IAA，這3種激素均能誘導葉子花生根，是單獨使用還是混合使用更有利于葉子花的生根目前還沒有統一的結論。Duhoky和AL-Mizory[22]對布蒂娜葉子花、葉子花和毛葉子花的生根研究發現，布蒂娜葉子花比葉子花和毛葉子花具有更高的生根率，它在1/4 WPM和1/4 MS上的生根率均為100%，而葉子花和毛葉子花在1/4 WPM培養基上比1/4 MS培養基上具有更高的生根率，葉子花的生根率分別為89.29%和82.14%，毛葉子花的生根率分別為96.43%和85.71%。葉頂英[38]在以1/2 MS、3/8 MS和1/4 MS為基本培養附加不同濃度的IBA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0、0.05、0.1 mg/L）和活性炭（0、0.5、1.0 mg/L）進行正交實驗的培養基上，獲得的最高生根率的培養基為1/4 MS+1.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA，生根率達92.53%。杜天奎和徐青[29]發現毛葉子花的最佳誘導培養基為1/2 MS+0.3 mg/L NAA。Shah等[25]發現毛葉子花品種‘Texans Dawn的最佳生根培養基為1/2 MS+2.5 mg/L NAA+2.5 mg/L IBA。Ahmad等[20]發現兩步法最有利于生根，即先將無根的小苗培養在1/2 MS+5.0 mg/L IAA+5.0 mg/L IBA 培養基上培養后再在1/2 MS+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L IBA培養。Javed等[23]報道毛葉子花品種‘Texans Dawn在改良的MS培養基+5.0 mg/L NAA+5.0 mg/L IBA培養基上，生根率可達70%。

利用愈傷組織分化獲得的試管苗由于較瘦弱，在生根培養前需要進行壯苗培養。龔偉等[20]報道壯苗培養基以MS+0.2 mg/L BA+0.5 mg/L GA3+0.1 mg/L NAA的效果最好，經過壯苗培養的小苗在MS+3.0 mg/L NAA培養基上生根率達到88.3%。

由于一些葉子花的組培苗試管內不生根，同時為了降低試管苗的生產成本，可進行試管苗的試管外生根。葉頂英[38]報道，葉子花在20 ℃～25 ℃，基質水分及空氣濕度控制在60%～90%，有較強的散射光的條件下，利用25、50、100 mg/L的IBA和ABT處理均能生根。在ABT濃度為50 mg/L效果最佳，試管外生根率為可達43%。

3 ?培養條件

已報道葉子花的培養溫度范圍為20 ℃～30 ℃，其中23 ℃～27 ℃應用最多[20-44]。光照范圍1 000～4 000 lx，多為1 500～3 000 lx。韓建軍[32]對葉子花的頂芽和帶腋芽的莖段進行組織培養時發現培養條件與玻璃化具有較大的相關性。在MS培養基中附加0.2、0.5和2.0 mg/L BA時，隨著BA濃度的升高，外植體玻璃化的比率升高。而在高溫（35 ℃）和陰暗的弱光培養條件下也易產生玻璃化。

4 ?組培苗的移栽

組培苗移栽是關系到能否實現工廠化育苗的關鍵，目前對葉子花組培苗移栽報道的主要是從基質、移栽溫度和濕度方面的研究。張波等[41]報道葉子花試管苗在選用基質為翻曬過的河沙與腐殖土作基質時，在腐殖土上的移栽成活率為96%，而在河沙上僅為85%。龔偉等[30]報道將發育良好的生根苗移出培養室，在室溫散射光下培養3 d，打開封口膜于溫室大棚中預2 d，洗去根部培養基，移栽于經福爾馬林消毒的河沙和蛭石（1 ∶ 1）為基質的小花盆中，置于半蔭處，并用地膜覆蓋保濕10 d，每天揭開地膜通風30 min，注意澆水，15 d后去除遮蔭網直接在自然條件下生長，30 d時成活率可達90%以上。李師翁[34]采用二步法移栽，即先鋪5 cm厚珍珠巖制作苗床，將生根苗洗凈培養基液后，均勻移入苗床，搭設塑料棚，并加遮陽網，使棚內光強在10 000 lux以下，保持濕度85%以上，溫度35 ℃以下，嚴格管理約4～5周后成活，然后將成活苗移入配制機制的營養缽中再進行常規管理，平均成活率達97%以上。

程治英[27]報道，試管苗的開花比扦插苗早，扦插苗開花約需2 a時間，而試管苗雙色葉子花（B. Red and white）移栽后83 d就開了花，多花葉子花（B. double）95 d開花，單花的毛葉子花（B. spectabilis）150 d開花。

5 ?問題與展望

國內外葉子花的組織培養技術已經有了一定的基礎，但還沒有形成一個比較完善的技術體系，較少應用于實際生產。其主要原因有：（1）外植體表面滅菌污染率高;（2）組織培養過程中易產生愈傷組織而愈傷組織又難再生植株;（3）生根困難;（4）移栽成活率較低;（5）生產成本較高。這些都是實現葉子花工廠化育苗的瓶頸。針對外植物體污染的問題，可以采用3個方面的措施進行防止：①對母株進行預處理，采集外植體時盡量選取帶菌少的材料;②采用合適的消毒方法，如給外植體消毒的時候，一般使用酒精和升汞結合的消毒方法[48]，還有一些比較特殊的方法，如減壓滅菌法[49]、臭氧消毒法[50]、間隙消毒法[51]、超聲波振動滅菌等[52];③培養基中加放適量抗生素等抗菌劑[48，52]。針對組織培養過程中易產生愈傷組織而愈傷組織難再生植株的問題，我們可從兩個方面進行解決。如果是進行優良品種的種苗生產，可通過采用培養基的優化、改變培養條件等方法盡量減少愈傷組織的產生，而如果需要進行葉子花的轉基因技術研究時，由于通過愈傷組織再生植物途徑是最有效的方式，我們同樣可以通過培養基的優化和改變培養條件等方法建立高效的愈傷組織再生體系。對于葉子花組織培養過程中生根難度大的問題，我們可以在優化培養基和培養條件的基礎上，采用濾紙橋等方式等進行生根誘導[53]或進行體細胞胚的誘導[54-55];也可以采用兩步生根法進行生根誘導，即先在含有生長素的生根誘導培養基上誘導生根，再轉移到不含激素但含活性碳的培養上完成根的生長[48，56]。對于移栽成活率低的問題，可通過煉苗，嚴格控制移栽環境的溫濕度來提高移栽的成活率。如果生產的品種是優良品種且規模較大，并且有高效的再生體系，生產成本自然也會大幅度降低而在市場上具有競爭力。總之，在以后的工作中， 要加強葉子花不同品種組織培養技術體系的研究， 獲得針對不同品種的高效、實用、標準的組培快繁體系;其次，在外植體處理及不定芽的誘導、增殖分化、生根壯苗等各個階段，對基本培養基類型、植物生長調節物質、培養基中添加物的選擇、培養條件等方面進行優化。

此外， 在葉子花組培快繁體系的基礎上， 應拓寬研究方向。如在建立穩定的葉子花再生體系的基礎上，通過誘變技術或轉基因技術培育葉子花新品種。目前，世界上葉子花的新品種選育主要通過芽變選種來實現的，也有通過物理和化學誘導選育新品種的報道[57-61]。葉子花的芽變選種即是從發生優良芽變的植株上選取變異部分的芽或枝條，用無性繁殖的方法使變異性狀得到延續和固定，經過初選、復選、決選等程序的選擇、觀察和鑒定，最后選出優良株系育成新品種[57]，而物理和化學誘導也能獲得葉型、葉色、花型、花色變化的植株[58-61]。由于獲得的新品種材料常常稀少，采用組織培養技術進行種苗大規模繁殖是最有效的方法。同時，利用轉基因技術可以定向地在基因水平上進行植物性狀的改變，如培育出抗鹽堿、抗寒、耐澇等抗逆性強的品種，以擴大葉子花在北方和惡劣環境的栽植面積;改變葉子花的葉型、葉色、花型、花色或延長花期并培養出具有芳香的品種， 而基因工程技術更是建立在以組織培養為基礎的有效轉化體系的基礎上。

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