綠絨海芋Alocasia micholitziana的組織培養及其植株再生的研究

楊建芬 郭彭斐 張兵劃 張壽洲

摘 ?要 ?以綠絨海芋Alocasia micholitziana的葉片、葉柄為外殖體，研究不同滅菌劑對外殖體消毒效果的影響、不同激素及濃度配比的培養基對愈傷組織誘導、不定芽分化及增殖的影響。結果表明：（1）消毒處理時葉柄適于用0.1% HgCl2浸泡處理8 min，葉片則為7 min;（2）葉柄、葉片在所試培養基中均能誘導出愈傷組織，最佳誘導培養基為MS+2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA，葉柄愈傷組織誘導率可達100%;（3）從愈傷組織誘導不定芽的最佳培養基為MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA，誘導率可達100%;（4）在培養基MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA上，芽增殖效果最佳，苗生長健壯;（5）最佳生根培養基為1/2MS+0.5 mg/L IBA，移栽后苗容易成活;（6）苗移栽時以泥炭土 ∶ 珍珠巖 ∶ 蛭石（3 ∶ 1 ∶ 1）成活率較高，可達98%以上，而且小苗生長健壯。

關鍵詞 ?綠絨海芋;葉柄、葉片;組織培養;植株再生

中圖分類號 ?S665 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ? A

Tissue Culture and Plantlet Regeneration of

Alocasia micholitziana

YANG Jianfen，GUO Pengfei，ZHANG Binhua，ZHANG Shouzhou*

Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity， Fairylake Botanical Garden， Shenzhen

& Chinese Academy of Sciences， Shenzhen， Guangdong 518004， China

Abstract ?An efficient protocol was established for the regeneration of an ornamental and food crop plant， ?Alocasia micholitziana using the leaves and petiole explants. The influence of both plant sterilization agents and various growth hormones at different concentrations on callus induction， adventitious bud differentiation and their proliferation were examined. The results ?revealed that soaking of plant explants in 0.1% of HgCl2 solution for 8 min was suitable for sterilization. The highest bud induction（100%）was achieved in three plant growth hormone combinations of 6-BA（2 mg/L）， 2，4-D（2 mg/L）and NAA（0.1 mg/L）in the MS culture medium. The optimum concentration for the highest induction（100%）of adventitious bud was 2 mg/L of 6-BA with 0.4 mg/L of NAA. The root was successfully induced in the half strength MS medium augmented with 0.5 mg/L of IBA. The in vitro regenerated plants were transf erred to the pot containing peat soil， perlite， and vermiculite（3 ∶ 1 ∶ 1）which showed the maximum survival rate（98%）.

Key words ?Alocasia micholitziana; Petioles; Leaf; Tissue culture; Plant regeneration

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.015

綠絨海芋Alocasia micholitziana（Green velvet）是天南星科海芋屬植物，原產熱帶地區，為多年生草本，葉片姿態優美、葉色濃綠，葉面有絲絨般感覺，葉脈銀白、清晰如畫，極富詩情畫意，為風格獨特的觀葉植物。室內擺設，高貴典雅。可水栽，淋洗盆土后，種于玻璃瓶中更顯清潔清爽，是觀賞價值較高的室內觀葉植物。綠絨海芋（圖版1-F）是從國外新引進開發的園藝品種，目前處于種苗繁育階段，僅有少量種苗供應市場。常規繁殖主要是通過分株方式和播種，其種子來源有限，自然分株率又低，周期長，很難滿足市場需要。利用組培方式可以快速繁殖種苗，達到推廣應用的目的。海芋屬植物組培報道的有海芋（Alocasia indica Schott）[1-3]、亞馬遜海芋（Alocasia amazonica）[4]、紫色莖稈海芋（Alocasia macrorrhiza）[5]、黑絨觀音蓮（Alocasia ‘Black Velver）[6]， 綠絨海芋的組培技術研究國內尚未見涉及，而國外已有報道[7]，但其愈傷組織誘導時間長達4個月，出愈率僅71%，本研究的最佳培養基MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA，至45 d時愈傷組織誘導率可達100%，大大縮短了離體培養時間，并且叢生芽增殖率也高，更適于工廠化規模生產。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為從臺灣辜嚴倬云保種中心引種回來的綠絨海芋，栽種于深圳市中科院仙湖植物園引種區。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外殖體的消毒處理 ? 當綠絨海芋新長出的幼葉完全展開5 d左右，將葉片和葉柄一起剪下。清洗干凈表面塵土后，用洗潔精水泡洗5～10 min，再用自來水沖洗，直到徹底將洗潔精清洗干凈為止。在無菌操作室內，將葉柄和葉片分開，分別用0.1%升汞溶液、5% NaClO溶液浸泡6～10 min，滅菌水沖洗4～6次，消毒濾紙吸干表面水分，將葉片切成1 cm×1 cm左右的方塊，葉柄切成1 cm左右的段，然后分別接入不同培養基中。隨時觀察記錄，35 d后統計結果。

污染率=（污染外殖體數/接種總數）×100%;剔除污染外殖體后，死亡率=（死亡外殖體數/未污染外殖體數）×100%。

1.2.2 ?愈傷組織及不定芽的誘導 ? 以MS為基本培養基，設置①6-BA 1.5 mg/L與2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）mg/L和②6-BA 2.0 mg/L與2，4-D（0.5、1.0 、1.5、2.0、2.5）mg/L共10個處理，研究不同激素及濃度配比的培養基對愈傷組織誘導和不定芽分化的影響。不定芽的統計以肉眼可辯獨立單芽為準。

分化率=（分化愈傷組織塊數/接種愈傷組織塊數）×100%。

1.2.3 ?不定芽的繼代增殖 ? 以MS為基本培養基，設置①6-BA 1.5 mg/L、2，4-D 2 mg/L與NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg/L和②6-BA 2.0 mg/L、2，4-D 2 mg/L與NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg/L等共10個處理，研究不同激素及濃度配比對綠絨海芋芽增殖的影響，以篩選出芽增殖效果最佳培養基。

1.2.4 ?生根培養 ? 以1/2MS為基本培養基，設置IBA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg/L 5個處理，研究不同濃度的IBA對不定芽生根的影響。

1.2.5 ?培養條件 ? 以上培養基均添加3%蔗糖，瓊脂粉5.5 g/L，pH值調至5.8。培養溫度25（±2）℃，光照時間16 h/d，光照度37～40 μmol/m2·s。

所有試驗的每個處理不少于10瓶，并重復5次。外殖體每瓶接種一個，不定芽的繼代增殖及生根培養每瓶接種5～7個。

1.3 ?數據處理

數據采用SPSS 21.0數據統計軟件進行方差分析和多重比較分析（Duncan's）法。

2 ?結果與分析

2.1 ?外殖體消毒效果

外殖體消毒效果如表1所示。葉柄外殖體在所有處理中的死亡率均為0，在處理4、處理8、處理9、處理10中的污染率為0，與其它處理差異顯著，綜合試驗及觀察以0.1% HgCL2消毒8 min降低綠絨海芋葉柄外殖體污染效果較好;葉片外殖體在處理5、處理9、處理10中的污染率為0，與其它處理差異顯著，死亡率以處理7為最低，綜合污染率及死亡率考慮，葉片以0.1% HgCL2消毒7 min降低污染效果較好。

2.2 ?不同激素類型對離體葉柄、葉片愈傷組織誘導及芽分化的影響

消毒后的外殖體接入培養基中進行培養，45 d后統計分析結果如表2。6-BA與2，4-D的不同濃度組合，對綠絨海芋的外殖體葉柄和葉片愈傷組織誘導差異顯著。尤其是當2，4-D的濃度大于2.0 mg/L時，差異明顯，其中葉柄作為外殖體時，愈傷組織誘導率最高達100%（圖1-A），葉片作為外殖體時，愈傷組織誘導率最高達98%。從愈傷形成所用時間來看，6-BA濃度為2.0 mg/L時，葉柄和葉片愈傷組織誘導的時間明顯短于6-BA濃度為1.5 mg/L時。從愈傷組織特點、形成時間、及出愈率3方面綜合看，以MS+2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA為最佳培養基，差異明顯。

將光滑致密的愈傷組織轉入不定芽分化培養基中進行培養，結果如表3。當培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D和MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D時，愈傷組織分化率為100%，與其它培養基組合差異顯著，當培養基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D時，平均芽數為16.01，與其它培養基差異顯著，是綠絨海芋最適合的分化培養基（圖1-B）。

2.3 ?不定芽的繼代增殖

將初代培養的不定芽切割成單芽以后，接入增殖培養基上進行增殖培養，25 d后增殖結果如表4。不定芽繼代增殖的結果因激素配比不同而異，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA增殖率最高（圖1-C），達17.36，其次為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，達15.40，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA處理最低，僅為5.96。在所試驗的激素濃度范圍內，NAA的增殖倍數整體高于IBA，且不同濃度之間差異顯著。

2.4 ?不同激素濃度對不定芽生根的影響

將生長健壯的不定芽切割成單芽后，接入生根培養基中進行培養，25 d后統計結果如表5。不同IBA濃度對綠絨海芋的不定芽生根有影響，生根率在濃度0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L之間無差異，均達100%，與前兩個濃度之間差異顯著。綜合對比表5中各項指標，以1/2MS+0.5 mg/L IBA為生根最優培養基。

2.5 ?移栽

待苗生根20 d左右，大部分葉片增厚變硬時，從培養瓶中取出，由于小苗根部纏繞在一起，先以流水沖凈培養基再分開小苗，移栽的基質以蛭石 ∶ 珍珠巖（5 ∶ 1）、泥炭土 ∶ 珍珠巖 ∶ 蛭石（3 ∶ 1 ∶ 1）或腐葉土 ∶ 蛭石（3 ∶ 1）為比例，在陰涼通風處培養，溫度保持l8～20 ℃以上，每天需灑水或噴霧，成活率均可達到98%以上，但以泥炭土 ∶ 珍珠巖 ∶ 蛭石（3 ∶ 1 ∶ 1）中的苗生長最為健壯（圖1-E）。

3 ?討論與結論

海芋屬植物離體培養的外殖體有花序[1]、塊莖[2]、根狀莖[3]、頂芽和側芽[5]、子球莖[6]和葉柄、葉片[7]。楊翠芹等[3]在海芋的預試驗表明，葉柄與葉片培養不但誘導不出愈傷組織，且會隨時間延長逐漸死亡;Nguyen Thi Phuong Thao等[7]僅從葉柄誘導出愈傷組織，也沒有獲得葉片愈傷組織的成功。以綠絨海芋的葉柄、葉片作為外殖體，獲得成功的關鍵在于外殖體取材時間，以幼葉展開5～10 d最好，太早幼葉太過幼嫩，消毒后易變黑死亡，即使不變黑也會先從周緣變黃或變褐，逐漸向中心部位擴展，直至干枯死亡，部分黃化的葉片整體發白，失去活力;葉柄太嫩時，端部易變黃，甚至褐色，雖不至于干枯死亡，但影響愈傷組織形成時間和速度。同時以葉柄、葉片作為外殖體，相對于其它部位具有取材不受時間限制，不會破壞整個植株，而且接種量大的優點。

2，4-D、6-BA、NAA、TDZ、KT等都被用來研究海芋屬愈傷組織的誘導與再生，葉柄、葉片愈傷組織誘導研究較少，即使有誘導率也較低。Nguyen Thi Phuong Thao等[7]以2，4-D與KT各0.5 μ/L的激素組合，用葉柄誘導愈傷組織，最高誘導率才達71%，且需暗培養4個月才誘導出愈傷組織。而本試驗以葉柄、葉片為外殖體，在MS+2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA培養基中培養，最短8 d開始產生愈傷組織，至45 d時愈傷組織誘導率可達100%。這可能與生長素和細胞分裂素的種類及濃度不同有關。

參考文獻

[1] 張新英. 海芋的離體培養及其試管苗水培研究[D]. 福州： 福建農林大學碩士學位論文， 2009.

[2] 高 ?鋌， 陳繼敏， 楊鎮明. 海芋的組織培養與快速繁殖[J]. 植物生理學通訊， 2006， 42（5）： 9-10.

[3] 楊翠芹， 劉運權， 方 ?穎， 等. 海芋根狀莖的離體培養與植株再生[J]. 北方園藝， 2007（5）： 212-213.

[4] 朱根發， 張遠能， 鄒春萍， 等. 亞馬遜海芋的組織培養和快速繁殖[A]. 廣州： 廣州農業科學院花卉研究所建所20周年論文選集（1984-2004）[C]. 2004.

[5] 王玉英， 許幫麗， 褚素貞， 等. 紫色莖稈海芋組織培養不同培養基的誘導增殖生根效果研究[J]. 西部林業科學， 2008， 37（4）： 89-92.

[6] 黃青峰. 黑絨觀音蓮頂芽培養和快速繁殖[J]. 福建熱作科技， 2002， 27（3）： 9-10.

[7] Nguyen Thi Phuong Thao， Yukio Ozaki， Hiroshi Okubo. Callus induction and plantlet regeneration in ornamental Alocasia micholitziana. Plant Cell[J]. Tissue and Organ culture， 2003， 73： 285-289.