糖網明目顆粒提取物對缺氧/高糖狀態下血管內皮細胞腫瘤壞死因子—α、白細胞介素—1α表達的影響

蒿長英等

摘要：目的 觀察糖網明目顆粒提取物對缺氧/高糖狀態下血管內皮細胞EA.hy926炎癥相關因子的影響，并探討其作用機制。方法 以CoCl2和高濃度葡萄糖干預人臍靜脈內皮細胞EA.hy926復制缺氧和高糖模型，MTT法檢測細胞增殖能力，半定量RT-PCR檢測炎癥相關基因表達，ELISA檢測炎癥相關蛋白表達。結果 缺氧和高糖均能促進EA.hy926細胞增殖，顯著上調腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1α（IL-1α）基因和蛋白表達（P<0.05）。藥物干預后，細胞增殖能力降低，TNF-α、IL-1α基因和蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。結論 糖網明目顆粒提取物可能通過調控缺氧/高糖狀態下內皮細胞TNF-α、IL-1α等炎癥相關因子的mRNA和蛋白表達從而達到防治糖尿病視網膜病變的目的。

關鍵詞：糖網明目顆粒提取物；糖尿病視網膜病變；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-1α；人臍靜脈內皮細胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0050-05

Effects of Tangwang Mingmu Granules on Expressions of TNF-α and IL-1α in Vascular Endothelial Cellsunder Hypoxia/High Glucose HAO Chang-ying1， CHEN Ming-xia2， GUO Ping3， MA Wen-bin1， LV Hai-bo3， DU Pei-pei1， ZHEN Lin-na3， LIU Ye4， LIAN Zeng-lin4 （1.Handian Group， Beijing Red Sun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Beijing 100103， China；2.Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；3. Handian Group，Beijing Handian Pharmaceutical Co.， Ltd.， Beijing 100103， China；4.Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Beijing 100103， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Tangwang Mingmu Granules on inflammation- associated cytokines in vascular endothelial cells EA.hy926 under hypoxic/high glucose. Methods CoCl2 and high glucose were used to make the hypoxic and high glucose model in human umbilical vein endothelial cell line EA.hy926. EA.hy926 cell proliferation was measured by MTT method. Gene and protein expression levels of inflammatory factors were detected by semi-quantitative RT-PCR and ELISA assay. Results Both hypoxia and high glucose promoted EA.hy926 cell proliferation. The gene and protein expressions of TNF-α and IL-1α were significantly up-regulated under the same condition （P<0.05）. The cell proliferation， TNF-α， IL-1α mRNA and protein expression levels were significantly reduced by treatment of Tangwang Mingmu Granules （P<0.05）. Conclusion The preventive and therapeutic effect of Tangwang Mingmu Granules on diabetic retinopathy might be related to down-regulate the expression of inflammation-associated cytokines of mRNA and protein， such as TNF-α and IL-1α.

Key words：Tangwang Mingmu Granules；diabetic retinopathy；tumor necrosis factor-α；interleukin-1α；human umbilical vein endothelial cell

基金項目：北京市科技計劃“十病十藥”中藥專項（Z121102001112007）

通訊作者：連增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com

糖網明目顆粒是基于中國中醫科學院眼科醫院高健生教授治療糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）的密蒙花方開發的中藥6類新藥[1]。臨床觀察顯示，該方對提高DR患者視力、改善視疲勞等臨床癥狀及眼底血管狀態療效顯著[2-3]。本課題前期研究結果表明，優化工藝制備的糖網明目顆粒提取物與傳統水煎煮工藝比較能明顯改善糖尿病大鼠視網膜微血管病理學狀態，降低血管生成相關因子的蛋白水平[4]。本實驗采用血管內皮細胞模擬DR缺氧/高糖病理環境，進一步探討缺氧/高糖狀態下糖網明目顆粒提取物對人臍靜脈內皮細胞EA.hy926炎癥相關因子的作用效果，并闡釋該藥防治DR的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞

人臍靜脈內皮細胞EA.hy 926，購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物

糖網明目顆粒處方由女貞子、烏梅、黃連、密蒙花、肉桂、黃芪、益母草組成，飲片購于安國市萌露中藥飲片有限公司，女貞子、烏梅、黃連、密蒙花均產于四川，肉桂產于廣西，黃芪產于內蒙，益母草產于河北，經北京漢典中醫研究院劉曄老師鑒定符合2010年版《中華人民共和國藥典》規定。糖網明目顆粒提取物由北京漢典中醫研究院提供，采取醇提、水提相結合的方法，將各藥材中主要藥效物質充分提取，最后經噴霧干燥制成提取物。

1.3 試劑

胎牛血清（FBS），Hyclone，SH30070.03；高糖DMEM培養液，Hyclone，SH30022.01B；0.25%胰蛋白酶， Hyclone，SH30042.01B；DMSO，Amresco，0231；青鏈霉素混合液，Solarbio，P1400-100；D-葡萄糖，天津市福晨化學試劑廠；MTT，Amresco，0793-1g；PCR試劑盒， TaKaRa，RR019A；ELISA試劑盒，北京鑫方程生物技術有限公司；CoCl2·6H2O，Sigma，C8661-25G；25 cm2細胞培養瓶、96孔細胞培養板、移液管。

1.4 儀器

YT-CJ-2ND型超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司），MCO-175CO2培養箱（SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學），MULTLSKAN MK3酶標儀（Thermo），DPL-ⅡA型噴霧制粒儀（重慶精工制藥機械有限責任公司），LXJ-ⅡA型離心機（上海安亭科學儀器廠），BIOMATE型紫外可見分光光度計（Thermo）， JY600電泳儀（北京君意東方電子設備有限公司）， ChampGel5000型全自動凝膠成像系統（北京賽智創業科技有限公司），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測缺氧/高糖細胞增殖能力

EA.hy926細胞第3代經胰酶消化，用普通培養液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸鏈霉素的高糖DMEM培養液）稀釋成2.5×104/mL細胞懸液，每孔200 μL接種于96孔培養板，細胞培養過夜后進行分組。空白組換用普通培養液，缺氧組換用CoCl2培養液，缺氧糖網明目顆粒干預組（缺氧+TWK組）換用CoCl2+糖網明目顆粒培養液，高糖組換用高糖培養液，高糖糖網明目顆粒干預組（高糖+TWK組）換用高糖+糖網明目顆粒培養液。每組設5個復孔，每孔加上述培養液200 μL，培養24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱內孵育4 h后，棄培養液，每孔加入100 μL DMSO，室溫振蕩15 min，混勻。待沉淀完全溶解后，用濾光片為492 nm酶標儀測定光密度（OD值）。計算抑制率。抑制率（%）=[OD值空白孔-OD值測量孔）÷（OD值空白孔-OD值調零孔）]×100%。

糖網明目顆粒培養液制備：精密稱定糖網明目顆粒提取物0.470 1 g，置50 mL離心管中，于超凈臺內加40 mL無血清高糖DMEM培養液，渦旋震蕩使藥物溶解，靜置30 min后混勻，以5000 r/min離心20 min，吸取上清液，用0.45 μm濾器無菌條件下過濾后，加入4.44 mL FBS，混勻，制成貯存液，封口，4 ℃冰箱內保存備用。此時貯存液含濃度為10 mg/mL，含10%FBS。臨用時將貯存液梯度稀釋至所需濃度2.5 mg/mL。

CoCl2培養液制備：精密稱定CoCl2·6H2O 0.023 7 g，加10 mL超純水，溶解，過濾，4 ℃保存，即得10 mmol/L CoCl2母液。臨用時用相應液體稀釋至50 μmol/L，混勻，進行細胞干預。

D-葡萄糖培養液制備：精密稱定0.459 0 g D-葡萄糖，放入36 mL高糖DMEM培養液中，混勻，溶解，過濾，加4 mL FBS，混勻，4 ℃密閉保存。此時，含葡萄糖100 mmol/L，含10%體積分數的FBS。臨用時用相應液體稀釋至40 mmol/L，混勻，進行細胞干預。

2.2 RT-PCR檢測缺氧/高糖細胞相關基因表達

總RNA的提取及質量檢測：將3×106個細胞接種于25 cm2培養瓶中，普通培養液培養過夜后，根據分組換用不同培養液繼續培養，24 h后棄培養液，4 ℃預冷的PBS洗3遍，加入1 mL RNAiso Plus，刮取細胞，吸至冰盒預冷的1.5 mL EP中，加入1/5體積的氯仿，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15 s，直至溶液充分乳化。室溫靜置5 min，4 ℃、13 500 r/min離心15 min。取出離心管，將上層透明水層吸至另一新的離心管中。加入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻。室溫靜置10 min，4 ℃、13 500 r/min離心10 min。小心倒去上清，向含有沉淀的離心管中緩慢加入-20 ℃預冷的75%乙醇1 mL，小心清洗沉淀。4 ℃、13 500 r/min離心5 min。除去上清，室溫干燥2 min，加入20 μL 1‰DEPC水溶解沉淀。紫外分光光度法測定總RNA濃度，用1‰DEPC水調整總RNA至相同濃度500 ng/μL。

cDNA反轉錄反應：冰上配制10 μL RT反應體系[2 μL MgCl2，1 μL RT Buffer，1 μL dNTP Mixture， 0.25 μL RNase Inhibitor，0.5 μL OligodT- Adaptor Primer，1 μL總RNA 樣本，3.75 μL RNase Free dH2O， 0.5 μL AMV Reverse Transcriptase]；反應條件：30 ℃、10 min，50 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min；半定量PCR反應引物，北京賽百盛合成。結果見表1。

瓊脂糖凝膠電泳及圖像分析：1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Lane ID凝膠圖像分析軟件對PCR產物進行半定量分析測定，基因表達水平以β-actin為參比。

2.3 ELISA檢測缺氧/高糖細胞相關蛋白表達

細胞分組及藥物干預同“2.1”項。藥物干預24 h后，吸取細胞上清液至預冷的1.5 mL無菌EP管中，同組混勻，封口，-80 ℃保存備用。BCA試劑盒測定總蛋白濃度，用PBS調整總蛋白至相同濃度。標準品按照說明書稀釋5個梯度，各梯度每孔加樣均為50 μL。分別設空白孔、待測樣品孔，每組3個復孔。向待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL，混勻。封板膜封板后于37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄液體，甩干，每孔加滿洗滌液，重復洗5次，拍干。每孔加入酶標試劑50 μL。封板膜封板后37 ℃溫育30 min，如前法重復洗5次，拍干。每孔先加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。450 nm波長處依序測各孔光密度（OD值）。以標準物濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品OD值代入方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量數據以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 糖網明目顆粒提取物對缺氧/高糖狀態下血管內皮細胞增殖能力的影響

與空白組比較，用CoCl2干預EA.hy926細胞造成缺氧狀態24 h后，該組細胞增殖能力顯著提高（P<0.05），提示缺氧狀態可以導致內皮細胞增殖；當加入糖網明目顆粒提取物干預后，細胞增殖能力被顯著抑制（P<0.05），提示糖網明目顆粒提取物能夠抑制缺氧狀態導致的內皮細胞增殖。同樣，用40 mmol/L葡萄糖干預EA.hy926細胞24 h后，與空白組比較，該組細胞增殖能力顯著提高（P<0.05），提示高糖狀態可以促進血管內皮細胞的增殖；以糖網明目顆粒提取物干預高糖狀態細胞24 h后，細胞增殖能力被顯著抑制（P<0.05）。見圖1。

4.2 糖網明目顆粒提取物對缺氧/高糖誘導的腫瘤壞死因子-α基因和蛋白表達的影響

血管內皮細胞缺氧24 h后，TNF-α基因及蛋白表達水平均顯著上調（P<0.05）；經糖網明目顆粒提取物干預24 h后，TNF-α基因及蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），見圖2。同樣，40 mmol/L葡萄糖干預細胞24 h后，TNF-α基因及蛋白表達水平均顯著上調（P<0.05）；經糖網明目顆粒提取物干預24 h后，TNF-α基因及蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），見圖3。

4.3 糖網明目顆粒提取物對缺氧/高糖誘導的白細胞介素-1α基因和蛋白表達的影響

血管內皮細胞缺氧24 h后，IL-1α基因及蛋白表達水平均顯著上調（P<0.05）；經糖網明目顆粒提取物干預24 h后，該基因及蛋白水平均顯著降低（P<0.05），見圖4。同樣，高糖干預細胞24 h后，IL-1α基因及蛋白表達水平顯著上調（P<0.05）；經糖網明目顆粒提取物干預24 h后，該基因及蛋白水平均顯著降低（P<0.05），見圖5。

5 討論

糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，常導致血液流變性及微循環障礙和代謝紊亂，引起組織水腫、缺血和缺氧，導致血管和神經病變[5]。DR是糖尿病常見的嚴重并發癥，也是主要的致盲疾病之一，其發病機制尚不清楚。研究發現，DR中有很多炎癥因素參與，因而提出DR是一種炎癥疾病[6]。本實驗采用人臍靜脈內皮細胞EA.hy926模擬DR病變過程中的缺氧/高糖狀態，藉以研究糖網明目顆粒對該病發病過程中炎癥因子的影響。

TNF-α在血管內皮細胞表面廣泛分布，與視網膜血管通透性、血管細胞增殖及眼內新生血管形成有關。研究發現，鏈脲佐菌素誘導的大鼠糖尿病模型中，TNF-α等炎癥因子水平明顯高于正常對照組[7]，2型糖尿病早期視網膜病變患者血清中TNF-α表達維持在高水平[8]。

IL-1可能是視網膜炎癥引起血視網膜屏障損害的重要因子，其可引起多核細胞和單核細胞向視網膜血管外遷移，血清蛋白向玻璃體內彌散及紅細胞向玻璃體內滲漏等，造成視網膜血管內皮細胞間出現許多大裂隙，使血-視網膜屏障出現缺損，導致局部水腫、滲出、出血和細胞浸潤，其對TNF-α促進新生血管形成的效應也具有協同作用。研究發現，KK/Upj-Ay小鼠血液和視網膜中TNF-α、IL-1β等炎癥因子基因和蛋白表達水平均高于正常對照組[9]。采用鏈脲佐菌素建立的SD大鼠糖尿病模型發現，早期DM大鼠視網膜中IL-6、IL-1α、TNF-α等mRNA轉錄水平均顯著高于正常組[10]。

本實驗結果顯示，糖網明目顆粒提取物不僅能抑制缺氧/高糖狀態下血管內皮細胞增殖，而且能顯著降低缺氧/高糖誘導的炎癥相關因子TNF-α、IL-1α的基因和蛋白表達水平。提示該制劑可能通過抑制糖尿病缺氧/高糖狀態下血管內皮細胞增殖相關炎癥因子，達到防治DR的作用效果。

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（收稿日期：2014-12-01）

（修回日期：2014-12-22；編輯：華強）