羊肚菌活性成分應急性抗疲勞功能的研究

段巍鶴等

摘要：[目的]為了解羊肚菌抗疲勞保健作用。[方法]通過水提法獲得羊肚菌胞外多糖、胞內多糖，破碎菌絲獲得胞內活性物質，對小鼠應急性一次灌胃處理后進行負重游泳實驗。為保證結果的可靠性，首次進行了對菌絲的ELISA免疫學方法檢測。[結果]胞外多糖組和胞內多糖組小鼠游泳時間與對照組比較均具有顯著性差異，說明胞外多糖、胞內多糖應急攝入后具有明顯的抗疲勞的作用。[結論]該研究為羊肚菌抗疲勞保健品的研發提供了參考。

關鍵詞：羊肚菌多糖；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）；抗疲勞

中圖分類號：S646.7 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-001-03

羊肚菌是一種世界公認的珍稀美味食用菌，目前還不能實現完全的人工栽培，通過深層發酵技術可以獲得羊肚菌菌絲體[1-5]。近年來的研究表明，羊肚菌還具有提高人體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等保健功效[6]。隨著現代生活節奏的加快，由于疲勞及過度疲勞、體力透支、身體抵抗力下降等亞健康狀態，工作效率降低，健康狀況受到威脅，抗疲勞藥物及保健品的研發越來越被人們所重視。參照通行的抗疲勞試驗方法，將提取的羊肚菌菌絲不同活性成分分為胞外多糖、胞內多糖、胞內活性物質組分，測定各組分對試驗動物的應急攝入后對增強機體在運動過程中抵抗疲勞、延長運動時間、增強機體的運動能力的影響[7-12]。研究結果表明，羊肚菌胞外多糖、胞內多糖與陰性對照組、羊肚菌胞內活性物質組相比具有明顯的抗疲勞作用。該研究結果為開發利用羊肚菌多糖，研制羊肚菌抗疲勞保健品提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株。羊肚菌菌株（51589號），購于中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試驗動物。ICR鼠由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。

1.1.3 試劑。鼠抗羊肚菌單克隆抗體（C6A8株，單抗為經過初步處理的腹水），長春理工大學生命科學技術學院制備并保存[13]；HRP標記山羊抗鼠IgG（H+L）與HRP標記山羊抗兔IgG（H+L），購于北京中杉金橋生物技術有限責任公司；TMB Sigma公司產品；PDA液體培養基組成為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨3 g，加蒸餾水1 000 ml，pH自然，121 ℃滅菌20 min。其他試劑均為國產分析純化學試劑。

1.1.4 主要儀器及設備。

恒溫振蕩培養箱，超凈工作臺，天平，CF-16RX離心機-HITACHI， ELx800TM 酶標儀-美國伯騰儀器有限公司，U-2800紫外型可見分光光度儀-日本日立公司，Y92-II超聲波細胞破碎機，游泳槽。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的活化、鑒定及擴大培養。

1.2.1.1 菌種活化。無菌操作將羊肚菌菌種試管斜面培養物移至無菌培養皿PDA固體培養基上，23 ℃培養5～7 d，得到菌絲培養物。

1.2.1.2 菌絲鑒定[14-15]。取適量培養得到的菌絲，加入到含有一定量的無菌海砂及一定體積的無菌生理鹽水的研缽中，研磨30 min，收集研磨液于離心管中，3 000 r/min離心5 min，取上清液作為待檢抗原。將研磨得到的抗原用包被緩沖液（pH 9.6碳酸鹽緩沖液）分別進行5、10倍稀釋，在12孔酶標條上1～4孔包被5倍稀釋的抗原，5孔為PBS緩沖液做陰性對照，6～10孔包被10倍稀釋的抗原，11孔為羊肚菌陽性對照，12孔做試劑空白對照；向包被好的各酶標孔加入100 μl 50倍稀釋的抗羊肚菌單克隆抗體，孵育60 min，洗滌3次，甩干，再向各孔中加入100 μl 2 000倍稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG（H+L），孵育60 min，洗滌3次，甩干，每孔中加入100 μl TMB底物，室溫避光15 min，每孔中加入50 μl 2 mol/L硫酸終止反應，經酶標儀檢測各孔的OD值。

1.2.1.3 菌絲擴大培養。將經檢測、鑒定了的羊肚菌菌絲，無菌操作轉移至含有無菌的100 ml液體PDA培養液的250 ml三角瓶中，用半透膜封口，置于21 ℃、115 r/min恒溫振蕩培養箱中培養5 d，做標記，收集培養物（菌絲球）、培養液，備用。

1.2.2 羊肚菌胞外多糖、胞內多糖及胞內活性物質的提取。

1.2.2.1 胞外多糖的提取。取300 ml過濾、離心獲得的不含菌絲的羊肚菌培養液，50 ℃恒溫水浴攪拌將體積濃縮至原體積的一半；采取Sevage法去蛋白，將去蛋白后的培養液加入其3倍體積的濃度95%乙醇在-20 ℃沉降24 h，析出絮狀白色物質，以4 000 r/min離心20 min得到白色沉淀，加入50 ml蒸餾水溶解后50 ℃水浴除去樣品中殘留的乙醇，得到胞外多糖，備用。

1.2.2.2 胞內多糖的提取。對經液體培養得到的菌絲體（球狀）用蒸餾水離心洗滌2次，獲得菌絲沉淀物，對沉淀按浸提比50∶1加入去離子水，85 ℃恒溫水浴浸提120 min，離心去除菌絲，離心上清液50 ℃恒溫水浴至原體積的一半，離心去沉淀，上清液沉淀多糖方法同胞外多糖沉淀方法，得到胞內多糖，備用。

1.2.2.3 胞內活性物質。取液體培養得到的菌絲體用蒸餾水離心洗滌2次，用超聲細胞破碎機對菌絲體進行破碎，功率180 W，每次超聲破碎時間10 s，間隔15 s，循環30次。可用冰浴降溫或停機避免破碎液溫度過高，破碎液經100×普通光學顯微鏡鏡下檢驗，至菌絲體完全破碎后，離心取上清液，上清液即為胞內活性物質，備用。

1.2.3 葡萄糖濃度曲線的建立與多糖濃度的測定。

利用苯酚硫酸法，測定溶液中多糖的濃度。分別配置100 μg/ml葡萄糖標準溶液和濃度6%的苯酚溶液各100 ml。準確吸取葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置于試管中，加蒸餾水補足至2.0 ml，加入濃度6%的苯酚溶液1.0 ml，混勻，小心地加入濃硫酸5 ml，混勻，置于沸水浴中煮沸15 min，迅速冷卻，以試劑空白溶液作參比，用1 cm比色皿在490 nm波長處測定吸光值。以葡萄糖質量（g）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，求得標準曲線的回歸方程。根據曲線的線性范圍，將樣品濃度做適當調整，檢測樣品吸光度，由線性方程求得樣品多糖濃度。

1.2.4 羊肚菌胞內、胞外多糖及胞內活性物質抗疲勞作用濃度的初步選擇。

隨機選擇ICR小鼠8只，稱重，隨機分成對照組、胞外多糖組、胞內多糖組、胞內物質組4組，每組2只，將上述各組分提取液分別配制成多糖濃度為14、4 mg/ml的溶液，對照組為蒸餾水。空腹灌胃，每只1 ml，立即測定各組小鼠力竭游泳時間，比較各組分與對照組及組內不同濃度多糖對小鼠力竭游泳時間的影響，根據試驗結果確定下一步試驗的多糖濃度。

1.2.5 羊肚菌胞內、胞外多糖及胞內物質抗疲勞作用的測定。

隨機選擇健康成年ICR小鼠20只，斷食1 d后稱重，隨機分成4組，每組5只鼠，分為對照組、胞外多糖組、胞內多糖組、胞內活性物質組。選擇上一步試驗確定的有顯著提高游泳時間的胞外多糖組、胞內多糖組、胞內活性物質組灌胃液多糖濃度，空腹灌胃，每只1 ml，立即測定各組每只小鼠力竭游泳時間。最后，對數據用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株ELISA間接法鑒定結果 由表1可知，經活化培養的菌絲，破碎處理后經5X（A1～A4孔）及10X（A6～A10孔）稀釋包被，P/N均大于2.1，為陽性；試驗的陽性（A11孔）、陰性（A5孔）對照成立。這說明活化培養后得到的菌絲為羊肚菌菌絲。

2.2 羊肚菌胞內、胞外多糖及胞內物質多糖濃度 根據測得的葡萄糖標準液含量與OD值的關系，求得線性方程為y=6.798 1x，R2=0.996 4，標準曲線見圖1。測得的樣品OD值及由線性方程求得的樣品多糖濃度見表2。

2.3 羊肚菌胞內、胞外多糖及胞內物質抗疲勞作用濃度的初步選擇 由表3可知，灌胃液的多糖濃度為14 mg/ml小鼠游泳時間明顯高于多糖濃度為4 mg/ml。

2.4 羊肚菌胞內、胞外多糖及胞內物質抗疲勞作用 由表4可知，胞外多糖組與對照組比較P=0.000 05，即P<0.01，表明胞外多糖組小鼠游泳時間與對照組小鼠游泳時間有0.01水平顯著性差異；胞內多糖組與對照組比較P=0.03，即P<0.05，表明胞內多糖組小鼠游泳時間與對照組小鼠游泳時間相比有0.05水平顯著性差異；胞內物質組小鼠游泳時間與對照組比較P=0.07，P>0.05，表明胞內活性物質組小鼠游泳時間與對照組小鼠游泳時間沒有顯著性差異；胞外多糖組與胞內多糖組比較P=0.297，P>0.05，表明胞外多糖組與胞內多糖組比較小鼠游泳時間沒有顯著性差異。

3 討論

（1）羊肚菌發酵液中的多糖（胞外多糖）及羊肚菌菌絲體內多糖（胞內多糖）溶液應急攝入后小鼠負重游泳時間與對照組比較存在著顯著性差異（P<0.05），表明2種多糖溶液均具有明顯的應激性抗疲勞作用。

（2）4、14 mg/ml羊肚菌胞外多糖和胞內多糖均可以延長小鼠負重游泳時間；在相同條件下，高濃度的羊肚菌多糖（胞外多糖、胞內多糖）對小鼠負重游泳時間明顯大于低濃度的羊肚菌多糖。

（3）胞內活性物質組小鼠游泳時間與對照組小鼠游泳時間沒有顯著性差異，說明影響小鼠應急性抗疲勞作用的主要成分是羊肚菌胞內與胞外多糖。胞內活性物質組內含有與胞內多糖的抗疲勞作用相互拮抗的物質，其成分、作用機理有待進一步研究。

（4）該研究結果驗證了羊肚菌多糖具有明顯的應急性抗疲勞保健作用。所采用的小鼠負重游泳試驗方法是在相關試驗方法的基礎上，根據試驗目的進行了一次性應急灌胃改動。該改動可以獲得直觀的試驗數據，并且有抗疲勞保健品使用上的實際意義。該研究中試驗方法的創新為研發具有應急性抗疲勞作用的保健品提供參考與借鑒。

（5）與相關文獻相比，該研究中首次引入ELISA免疫學檢測方法對菌絲進行鑒定檢測，對試驗結果的可靠性提供了保障。

（6）與相關文獻相比，該研究得到的應急性灌胃小鼠游泳時間即羊肚菌多糖的抗疲勞作用明顯高于其他報道。這個結果或許與該研究所采用菌種的長期傳代馴化培養、菌絲活性多糖組分的含量變化有關。

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