超高效液相色譜－串聯(lián)質譜法檢測牛奶中7種氨基糖苷類藥物殘留

劉雪紅，張秀芹，侯 穎，喬 穎，宋 平，馬曉建，季 磊，戚 驥

(1.大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連116037;2.遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所，沈陽110000)

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides，AGs)，是由鏈霉菌或小單孢菌培養(yǎng)液中提取或以天然品為原料半合成制取而得的一類水溶性較強的堿性抗生素。具有靜止期殺菌作用，對革蘭氏陰性和陽性菌均有很好的抑殺作用，屬于廣譜抗生素［1］。由于高效和低價，其廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)中，常被用在奶牛養(yǎng)殖過程中，用來治療奶牛的多種疾病［2］。氨基糖苷類抗生素在動物性食品中的殘留對人體具有潛在危害，可引起聽力減退、耳鳴或耳部飽滿感等耳毒性反應以及腎毒性反應等。農(nóng)業(yè)部公告第235號［3］規(guī)定了氨基糖苷類抗生素在動物源性食品中的限量要求。

目前，AGs藥物殘留的檢測方法主要有微生物法［4］、免疫分析法［5］、液相色譜法［6］及液相色譜 －串聯(lián)質譜法［7－8］。微生物法檢測周期長，專屬性差;免疫分析法樣品前處理簡單、檢測速度快，但容易產(chǎn)生假陽性或假陰性的結果;液相色譜法需要衍生化，操作較為繁瑣，穩(wěn)定性差。液相色譜一串聯(lián)質譜法是應用較廣泛的檢測此類抗生素的方法。AGs易溶于水，極性強，在C18柱上保留弱，文獻報道較多的是在流動性中加入離子對試劑——七氟丁酸、五氟丙酸等［9］，增強其在柱上的保留。本文采用CORTECS HILIC色譜柱，甲酸銨溶液作流動相，避免了離子對試劑、儀器的污染。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 電子天平RD－200，德國 Sartorius公司;高速冷凍離心機Sigwa2K15，sigma公司;強力漩渦混和器REAX top，德國Heidolph;臺式酸度計FE 20，瑞士梅特勒;XEVO TQ－S ACQUITY UPLC超高效液相色譜－串聯(lián)質譜儀，配置電噴霧離子源，美國Waters公司;色譜柱ACQUITY CORTECS HILIC 100 mm×2.1 mm ×1.6 μm，Waters公司;固相萃取柱:WP CBX(500 mg/6mL)，J.T.Baker公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標準品 鏈霉素批號 CA16974900、含量99.0%，雙氫鏈霉素批號C12635300、含量99.0%，慶大霉素批號C14000200、含量94.4%，卡那霉素批號C14505520、含量90.0%，丁胺卡那霉素批號C10164000、含 量 90.0%，安 普 霉 素 批 號C10293000、含 量 81.5%，大 觀 霉 素 批 號C16972700、含量90.0%，均為德國 Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品。

1.2.2 試劑 乙腈、甲酸、甲醇為色譜純;水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水;乙酸、甲酸銨為優(yōu)級純;乙酸銨、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉為分析純。

乙酸銨緩沖液的濃度C乙酸銨=10 mmol/L:稱取0.77 g乙酸銨，加入900 mL水，用1 mol/L鹽酸調節(jié)pH 為4.0，再加入0.15 g乙二胺四乙酸二鈉、5 g氯化鈉和20 g三氯乙酸，混勻，加水至刻度即得。

1.2.3 標準貯備液的配制 準確稱取鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、大觀霉素標準品各25 mg，以水定容至25 mL，混勻，即為1000 μg/mL的標準貯備液;4℃避光保存于塑料試管中，有效期為3個月 (AGs易與玻璃制品發(fā)生吸附，實驗過程中盡量都使用塑料制品)。然后用70%乙腈溶液逐步稀釋成適當濃度的混合標準工作液，保存于塑料試管中。

1.3 測定方法

1.3.1 樣品處理 稱取2 g(精確到0.01 g)均質樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙酸銨緩沖液，渦旋振蕩提取，10000 r/min離心5 min，倒出上清液，5 mol/L 氫氧化鈉調 pH 至7.5±0.5，混勻。用5 mL甲醇和5 mL水活化CBX柱(500 mg/6mL)，將提取液過柱，5 mL水淋洗，用3 mL 10%乙酸甲醇溶液洗脫，40℃氮氣吹干［10］。加入0.4 mL 70%乙腈溶液，充分渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，上機待測。

1.3.2 液相色譜條件 柱溫30℃，進樣量5 μL，流動相:A為200 mmol/L甲酸銨水溶液(pH 2.5)，B為150 mmol/L甲酸銨(乙腈∶甲醇∶水=60∶10∶30)溶液(pH 4.0);梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.3.3 質譜條件 離子掃描方式:正離子，檢測方式:多反應監(jiān)測，霧化器壓力0.7 MPa，干燥氣流量1000 L/h，干燥氣溫度550℃，毛細管電壓3000 V，定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量見表2所示。

表2 7種AGs藥物定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量表

1.3.4 標準曲線繪制 精密量取2 μg/mL混合標準工作液 0.02、0.04、0.10、0.40、1.00 mL，分別添加到2 g空白牛奶中，按1.3.1項處理，得到濃度分別為0.1、0.2、0.5、2、5 μg/mL 的基質匹配標準曲線溶液。

2 結果

2.1 標準曲線 以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，基質匹配標準溶液濃度(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線(表3)。7種AGs藥物在0.1～5 μg/mL的范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均在0.996以上(表3)。

2.2 檢測限和定量限 添加適量混合標準工作液于空白牛奶中，經(jīng)提取后測定。根據(jù)特征質量色譜峰的信躁比S/N＞3為檢測限，信躁比S/N＞10為定量限，檢測到7種AGs藥物的檢測限為10 μg/kg，定量限為 20 μg/kg。空白牛奶中添加 20 μg/kg的7種AGs藥物特征離子質量色譜圖見圖1。

2.3 回收率及重復性試驗 在空白牛奶中添加3個不同濃度(20、50、200 μg/kg)7 種 AGs藥物，進行回收率試驗，每個添加濃度做5個平行，連續(xù)測定3批，其平均回收率、相對標準偏差見表4。從表中試驗結果可以看出7種藥物的添加回收率在80%～117.5%之間，批內批間相對標準偏差均小于15%。

表3 7種AGs藥物的標準曲線及相關系數(shù)表

圖1 空白牛奶中添加20 μg/kg的7種AGs藥物特征離子質量色譜圖

表4 7種AGs藥物回收率及重復性試驗結果表 (n=5)

3 討論與小結

3.1 樣品處理條件的選擇 該類藥物溶于水，采用低pH緩沖液可有效提取，同時加入三氯乙酸除蛋白質。已報道的固相萃取柱有羧基柱(CBX)、C18柱、親水親脂平衡柱(HLB)等，本方法采用CBX柱，達到了滿意的效果。

3.2 色譜條件的選擇 流動相中添加改性劑，增加藥物在柱上的保留。甲酸銨水溶液－乙腈是HILIC常用的流動相［11］，因此考察不同濃度甲酸銨溶液對色譜峰形的影響。最終確定200 mmol/L甲酸銨水溶液(pH 2.5)、150 mmol/L甲酸銨(乙腈∶甲醇∶水=60∶10∶30)溶液(pH 4.0)作為流動相，同時優(yōu)化了梯度洗脫程序，得到了分離度以及對稱因子均較好的峰形。AGs藥物極性強，在C18柱上保留弱;親水作用色譜柱，可以有效的延長保留時間，同時HILIC色譜柱使用的高比例揮發(fā)性有機相亦有助于質譜響應值的提高。選擇ACQUITY UPLC BEH HILIC和ACQUITY CORTECS HILIC兩種色譜柱進行比較，結果發(fā)現(xiàn)采用 ACQUITY CORTECS HILIC色譜柱時，待測物的靈敏度和峰型都比較好。

3.3 基質效應研究 由于液相色譜－串聯(lián)質譜存在基質效應［12－13］，而且乳品樣品基質復雜，含有大量的內源性化合物，因此對樣品基質效應進行研究。比較3個不同條件下的信號峰面積:純的標準品溶液，樣品基質提取后添加，樣品基質提取前添加。在優(yōu)化實驗條件下，用空白樣品按1.3.1項方法制作空白基質吹干后，加入一定量標準溶液，制成基質標準溶液;在空白樣品中加入一定量標準溶液，按1.3.1項方法制成基質匹配標準溶液;與相應濃度的純標準溶液比較。實驗結果發(fā)現(xiàn)，基質效應明顯，因此定量時采用基質匹配標準曲線。

3.4 進樣溶液的選擇 選擇水、150 mmol/L甲酸銨70%乙腈溶液、70%乙腈為進樣溶液。采用水為進樣溶液時，卡那霉素、丁胺卡那霉素、大觀霉素峰展寬且峰形不對稱;采用150 mmol/L甲酸銨70%乙腈溶液時，上述藥物峰形對稱，但峰展寬;70%乙腈為進樣溶液，峰形對稱而尖銳。最終確定70%乙腈作為進樣溶液。

本方法確立的用超高效液相色譜－串聯(lián)質譜技術，可同時檢測牛奶中7種AGs藥物殘留，滿足其限量要求。樣品處理簡單，快速，檢測方法準確、可靠。

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