流產嗜性衣原體MIP蛋白單克隆抗體的制備及特性鑒定

藺俊麗，李兆才，曹小安，趙 榮，周繼章

(中國農業科學院蘭州獸醫研究所，蘭州730046)

流產嗜性衣原體(Chlamydophila abortus)是嚴格細胞內寄生的革蘭氏陰性細菌，是一種重要的人獸共患病病原。動物感染流產嗜性衣原體可引起妊娠母畜流產、死產或者產弱胎，公畜發生睪丸炎、尿道炎等癥狀，孕婦與感染的動物直接接觸也會造成流產及全身感染等癥狀。國內目前對該病的檢測方法是間接血凝實驗(IHA)，該法雖然操作簡單，但有不可避免的主觀性，容易在臨床上造成誤診，為控制和凈化該病帶來困難。對該病的治療目前一般采用抗生素治療，但容易導致細菌產生耐藥性，引發持續、慢性、亞臨床感染。

流產嗜性衣原體巨噬細胞感染增強蛋白(Macrophage infectivity potentiator，MIP)作為一種免疫顯性抗原［1－2］近年來越來越多的被研究。本研究利用前期純化的重組MIP蛋白制備單克隆抗體，以期為進一步建立敏感的診斷方法以及流產嗜性衣原體的治療和相關致病機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與動物 流產嗜性衣原體SX5標準株、骨髓瘤細胞SP2/0為蘭州獸醫研究所人獸共患細菌病研究室保存，SPF級Balb/c小鼠(雌性，8周齡)購自蘭州獸醫研究所動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640、HAT和HT選擇培養基以及胎牛血清，Gibco公司;細胞融合劑PEG4000、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司;細胞培養瓶、96孔細胞培養板、酶標板，Corning公司;單克隆抗體亞類檢測試劑盒，Protein tech公司;SPF雞胚，北京媯川亞申養殖中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠免疫及MIP多克隆抗體的檢測 將純化的重組MIP蛋白與弗氏完全佐劑乳化完全后，免疫3只小鼠，腹腔注射和皮下多點注射(50 μg蛋白/只)，二免、三免于第14天、第28天進行，用不完全弗氏佐劑乳化。第三次免疫7 d后，小鼠尾靜脈采血，分離血清，間接血凝法測定效價，選擇高效價者加強免疫3 d后進行細胞融合試驗，小鼠血清保存備用。

1.2.2 細胞融合 參照文獻［3］無菌分離免疫鼠脾臟制備脾淋巴細胞懸液，以4∶1數量與SP2/0骨髓瘤細胞混合，室溫1200 r/min離心8 min，使細胞沉淀，移去上清，往沉淀中緩慢加入1 mL預熱40℃的 PEG(40%)，時間控制在60 s左右，HAT培養基定容細胞懸液體積至50 mL后，轉入鋪有飼養細胞的96孔細胞培養板中(100 μL/孔)，37℃，5%CO2溫箱中靜置培養10 d。

1.2.3 雜交瘤細胞的篩選及雜交瘤細胞株的建立

用純化的MIP蛋白作為包被抗原，以融合細胞的上清液為一抗，間接ELISA檢測篩選分泌抗MIP蛋白抗體的陽性克隆。將初步篩選得到的疑似陽性細胞克隆株，用HT培養基有限稀釋后，再進行3次亞克隆，用同樣的方法篩選，至陽性率達到100%，將所得的細胞株擴大培養，建株保存，培養上清即含有大量單克隆抗體。

1.2.4 抗MIP蛋白單克隆抗體的特性鑒定

1.2.4.1 間接ELISA方法檢測抗體效價 以純化的重組MIP蛋白包被酶標板(2 μg/孔)，4℃過夜，PBST洗滌四次，5%BSA 37℃封閉1 h，洗滌，將單克隆抗體上清經倍比稀釋加入，37℃孵育45 min，洗滌，加入HRP標記的羊抗鼠二抗(1∶10000)，37℃孵育45 min后洗滌，加入顯色劑TMB，避光反應10 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應，立即于酶標儀上讀出每孔450 nm處的吸光值，以產生陽性反應的最高稀釋倍數為其效價，同時以SP2/0骨髓瘤細胞培養上清為陰性對照。

1.2.4.2 單克隆抗體亞類鑒定 操作步驟按照Protein tech公司小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書進行。

1.2.4.3 單克隆抗體腹水制備以及相對親和力鑒定 按常規方法［4］取8周齡Balb/c小鼠進行腹水制備，并純化腹水單抗。以純化的重組MIP蛋白(2 μg/孔)包板，單抗濃度依次為 80、40、20、10、5 μg/mL，每個梯度三孔，37 ℃孵育 45 min，洗滌后加入酶標二抗(1∶10000)，37℃孵育45 min后洗滌，加底物顯色測定，按50%最大結合的單抗計算其相對親和力。

1.2.4.4 單克隆抗體特異性鑒定 將接種流產嗜性衣原體的雞胚卵黃囊膜研磨，加入SPG緩沖液，5000 r/min離心15 min以除去大塊組織，棄去沉淀，保留上清，14000 r/min離心30 min以沉淀衣原體，棄去上清，保留沉淀，用SPG重懸沉淀后進行超聲破碎，超聲功率400 W，超聲5 s間隙5 s，超聲30 min后將流產嗜性衣原體進行SDS－PAGE，23 V轉膜20 min，5%脫脂奶粉(PBST稀釋)孵育1 h后，以純化的腹水為一抗(1∶1000，2% 脫脂奶粉稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗滌5次，每次3 min，以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗(1∶10000)室溫孵育1 h后PBST洗滌，進行顯色曝光。

1.2.4.5 雜交瘤細胞株染色體核型分析 參照文獻［5］采用秋水仙素阻斷法進行染色體計數。選擇

對數生長期的雜交瘤細胞，加入秋水仙素溶液，終濃度0.4 mmol/mL，繼續培養6 h后，用10 mL離心管1000 r/min離心10 min，棄上清，緩慢加入5 mL 37℃遇熱的KCl(0.75 mol/L)重懸沉淀，置37℃15 min后加入1 mL固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)1 mL，緩慢混勻，1000 r/min 離心10 min，加5 mL固定液重懸沉淀，室溫放置15 min，1000 r/min離心10 min，棄上清，重復一次后重懸，吸取100 μL懸液，于1.5 m高度處垂直低落在－20℃預冷的載玻片上，自然風干后，滴加吉姆薩染色液，20 min后輕柔的洗去染色后，100×油鏡顯微鏡觀察染色體數目。

1.2.4.6 雜交瘤細胞株分泌抗體穩定性試驗 參照文獻［6］將雜交瘤細胞傳代20次，每次傳代測細胞培養上清的抗體效價;將雜交瘤細胞反復凍存復蘇，測抗體效價;將液氮罐中凍存的陽性雜交瘤細胞，每20 d復蘇一次，連續3個月，測上清液中的抗體效價。

1.2.4.7 流產嗜性衣原體中和試驗 用SPG緩沖液倍比稀釋 C.abortus(1∶1、1∶2、1∶4、1∶8)，與相同體積的單克隆抗體混合，接種200個雞胚，同時設培養基對照組(每株單抗接種100個雞胚，每個稀釋梯度以及對照組20個雞胚)。培養3 d后每天檢查死亡雞胚數，直到第9天，培養結束后計算雞胚相對死亡率。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立 經3次小鼠常規免疫和一次加強免疫，細胞融合和3次亞克隆，挑選出疑似陽性克隆，以純化MIP蛋白包被酶標板，間接ELISA鑒定疑似陽性細胞克隆，共挑選出7個陽性克隆，繼續傳代培養后得到2個強陽性。陽性克隆連續亞克隆3次，反復凍存和復蘇之后仍能穩定分泌單克隆抗體，確定為陽性雜交瘤細胞株，并命名為 M 1，M 3。

2.2 單克隆抗體效價及亞類鑒定 ELISA方法測定兩株單克隆抗體的效價均為1∶1600(表1);利用單抗亞型鑒定試劑盒對2株單抗進行亞型鑒定，兩株單抗均為IgG1，輕鏈均為κ鏈(圖1)。

表1 間接ELISA對M1和M3雜交瘤細胞培養上清抗體效價的測定結果

圖1 M1和M3抗體類及亞類鑒定結果

2.3 單克隆抗體相對親和力鑒定 ELISA方法測定單抗相對親和力，兩株單抗50%最大結合濃度均為10 μg/mL，50%最大結合濃度越低，表明親和力越大，所需抗體濃度越低。

2.4 抗體特異性鑒定 在27 kD左右出現明顯的兩條帶，而其他地方沒有，說明兩株單克隆抗體能特異性識別重組MIP蛋白，結果見圖2。

圖2 M1和M3 Western blot特異性鑒定圖

2.5 雜交瘤細胞系染色體分析 用秋水仙素阻斷法進行染色體數目統計，兩株雜交瘤細胞染色體數目相對穩定，Balb/c小鼠脾細胞和SP 2/0的染色體數目分別為20對和31～34對，則所獲的雜交瘤細胞數應該51～54對之間，結果見圖3。

圖3 M1和M3雜交瘤細胞染色體鏡檢圖(吉姆薩染色，100×)

2.6 雜交瘤細胞株分泌單克隆抗體穩定性試驗胞體外傳代20次，反復凍存復蘇8次，仍能穩定分泌單克隆抗體，且將液氮罐中凍存3個月的雜交瘤細胞復蘇，仍能穩定分泌抗體。

2.7 流產嗜性衣原體中和試驗 2株單克隆抗體經倍比稀釋后與同體積經SPG稀釋的C.abortus混合，感染雞胚，同時用培養基做對照。結果兩株單克隆抗體均能降低雞胚感染率，雞胚感染率0～10%，而對照組感染率明顯高，為95% ～100%，說明所制備的MIP單克隆抗體具有良好的中和作用，能有效阻斷感染(圖4)。

圖4 M1和M3對流產嗜性衣原體的中和試驗結果

3 討論

MIP最初發現于嗜肺軍團菌中，作為毒力因子［7］在軍團菌胞內感染早期發揮重要作用。此后，在銅綠假單胞菌［8］、伯納特立克次氏體［9］、大腸桿菌［10］以及鸚鵡熱衣原體［2］、肺炎衣原體［11］中陸續發現了Mip樣蛋白和mip樣基因。

MIP是一種“經典”的細菌脂蛋白［12］，在衣原體發育的兩個階段均有表達［13］。MIP在CD14的幫助下激活 TLR2/TLR1/TLR6通路［12］，表明 MIP在衣原體感染中參與了引發炎癥反應的致病機制。此外，流產嗜性衣原體MIP蛋白相對于以往衣原體研究的優勢蛋白MOMP、POMP等，與血清有較高的反應性［14］，這表明在流產嗜性衣原體感染過程中MIP蛋白扮演了重要角色。

本研究利用前期純化的重組MIP蛋白，運用特異、靈敏的間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞株，獲得了兩株單抗。進一步利用細胞核型分析、單抗亞型鑒定、單抗親和力、單抗中和活性鑒定、單抗特異性鑒定對兩株單抗進一步確認和評價。雖然采用了常規方法，但獲得了兩株特異性高、穩定性好的理想單抗。

對于單抗中和能力的鑒定，陸春雪等［1］利用制備的單抗與衣原體混合后感染Hela細胞，然后對細胞進行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察以確定單抗的中和能力。本研究采取類似的方法將單抗與流產嗜性衣原體經倍比稀釋，充分混合后接種雞胚，從第3天開始每天查看雞胚死亡情況直到第9天，直接計算各稀釋度所有天數中總的雞胚死亡率，以此判定MIP蛋白單克隆抗體的中和能力。本研究接種雞胚的方法雖然傳統，但是操作簡便，假陽性概率低，結果可靠。通過中和試驗驗證了抗MIP單抗能顯著降低雞胚感染死亡率，由此可以判定，在流產嗜性衣原體感染雞胚過程中，MIP做為一種毒力因子被其單克隆抗體中和，也從另外一個方面說明了流產嗜性衣原體MIP在動物感染過程中扮演著重要的角色，這為進一步研究流產嗜性衣原體感染動物的致病機制提供了新的思路。

此外，兩株單抗50%最大結合濃度達到10 μg/mL，抗體親和力較高，結合半抗原能力較強，這為后續建立雙抗體夾心ELISA，阻斷ELISA等敏感的、特異的檢測方法奠定了基礎。

總之，制備成功的兩株單克隆抗體不僅對于建立敏感的動物衣原體病診斷方法奠定了基礎，也為進一步研究流產嗜性衣原體的致病機制提供了新的思路。

［1］Chunxue Lu，Bo Peng，Yimou Wu，et al.Induction of protective immunity against Chlamydia muridarum intravaginal infection with the chlamydialimmunodominantantigen macrophageinfectivity potentiator［J］.Microbes and Infection，2013(15):329 －338.

［2］Rockey D D，Chesebro B B，Heinzen R A，et al.A 28 kDa major immunogen of Chlamydia psittaci shares identity with Mip proteins of Legionella spp.and Chlamydia trachomatis －cloning and characterization of the C.psittaci mip －like gene［J］.Microbiology，1996，142(Pt4):945－953.

［3］趙 凱，孫立新，孫宇石，等.抗紫杉醇單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立［J］.中國新藥雜志，2012，21(4):436－442.

［4］繆芬芳，白海燕，白 昀，等.豬肺炎支原體DnaK蛋白質單抗的制備與鑒定［J］.江蘇農業學報，2012，28(6):1361－1366.

［5］江 淼，沈 飛，包紅雨，等.大鼠抗小鼠重組膜聯蛋白A2單克隆抗體的制備與鑒定［J］.蘇州大學學報，2011，31(6):879－892.

［6］王 錚，王鐵成，馮 娜，等.犬瘟熱單克隆抗體的制備及其生物學特性鑒定［J］.動物醫學進展，2014，35(3):73－77.

［7］Rolf Ko hler，Jorg Fangha nel，Bettina Ko nig.Biochemical and functional analyses of the mip protein:influence of the N－terminal half and of peptidylprolyl isomerase activity on the virulence of Legionella pneumophila［J］.Infection and Immunity，2003，71(8):4389－4397.

［8］Konyecsni W M，Deretic V Konyecsni W M，et al.DNA sequence and expression analysis of aIgP and aIgQ，components of the multigene system transcriptionally regulating mucoidy in Pseudomonas aeruginosa:aIgP contains multiple direct repeats［J］.J Bacteriol，1990，172(5):2511 －2520.

［9］Nicholas P Cianciotto，William O Connell，Gregory A Dasch，et al.Detection of mip－like sequences and mip－related proteins within the family Rickettsiaceae［J］.Current Microbiology，1995，30(3):149－153.

［10］Horne S M，Young K D.Escherichia coli and other species of the Enterobacteriaceae encode a protein similar to the family of Mip － like FK506 － binding proteins［J］.Arch Microbiol，1995，163(5):357－365.

［11］Lain R Peters，Michael J Day，Severine Tasker，et al.Antigen specificity of the humoral immune response to Mycoplasma haemofelis infection［J］.Clinical and Vaccine Immunology，2010，17(8):1238－1243.

［12］Sylvette Bas，Laurence Neff，Cem Gabay，et al.The proinflammatory cytokine response to Chlamydia trachomatis elementary bodies in human macrophages is partly mediated by a lipoprotein，he macrophage infectivity potentiator，through TLR2/TLR1/TLR6 and CD14［J］.J Immunol，2008，180(2):1158 －1168.

［13］Laurence Neff，Sawsan Daher，Sylvette Bas，et al.Molecular characterization and subcellular localization ofmacrophage infectivity potentiator，a Chlamydia trachomatis lipoprotein［J］.Journal of Bacteriolgy，2007，189(13):4739－4748.

［14］Marques P X，Puneet Souda，Nally J E，et al.Identification of immunologically relevant proteins of Chlamydophila abortus using sera from experimentally infected preguant ewes［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17(9):1491.