1株雞H9亞型禽流感病毒的分離鑒定和HA基因序列分析

鐘植文，冼望強(qiáng)，黎先偉，何柳芬，劉 薇，楊傲冰*

(1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州511356;2.廣東省動(dòng)物防疫物資儲(chǔ)備中心，廣州510520)

禽流感是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征，分高致病性和低致病性兩種，低致病性以H9亞型禽流感為主［1］。目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞場(chǎng)多常用BJ94類，如F、SS、SD696等毒株的疫苗，起到一定的預(yù)防作用，但未能達(dá)到100%的完全保護(hù)，仍有 H9亞型禽流感發(fā)生［2－3］。2013年冬，廣東珠三角地區(qū)某雞場(chǎng)的肉雞群發(fā)病并出現(xiàn)死亡，發(fā)病前4天死亡率共計(jì)超過(guò)1%。本試驗(yàn)從發(fā)病肉雞群中采樣，經(jīng)病毒的分離、鑒定，確定為H9亞型禽流感病毒。對(duì)分離株的HA基因進(jìn)行序列測(cè)定和分析，并與近年流行的H9亞型禽流感毒株和部分常用疫苗毒株HA基因、蛋白進(jìn)行相似性比較和分析，旨在從分子水平上了解廣東地區(qū)目前H9亞型禽流感病毒的毒力特點(diǎn)，為該病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣本 于2013年采自廣東珠三角地區(qū)某雞場(chǎng)的發(fā)病肉雞群。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 10日齡SPF雞胚由廣東永順生物制藥股份有限公司提供。

1.1.3 試劑 新城疫病毒、減蛋綜合癥病毒、禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)、H5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自廣東省動(dòng)物防疫監(jiān)督所;MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、M － MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP、Premix Ex Taq購(gòu)自 TaKaRa(大連)公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離和傳代 采集發(fā)病雞的氣管、肺臟等臟器，研磨后凍融3次，3000 r/min離心8 min，上清液經(jīng)細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌。濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚8只，0.2 mL/只，接種后置37℃溫箱孵化，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，每天照胚三次，將死亡雞胚置于4℃冰箱，至第96 h將全部雞胚置于4℃冰箱。觀察死亡雞胚病變，收獲死亡雞胚和凍死雞胚尿囊液，并作無(wú)菌檢查，然后連續(xù)傳代。

1.2.2 血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［4－5］配制1%雞紅細(xì)胞懸液，取分離株雞胚尿囊液進(jìn)行微量血凝試驗(yàn);然后具有血凝活性的雞胚尿囊液分別與新城疫病毒、減蛋綜合癥病毒和禽流感病毒H5亞型、H7亞型、H9亞型的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行微量血凝抑制試驗(yàn)。

1.3 基因型鑒定

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)該毒株的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從GenBank上獲取多株H9亞型AIV基因序列分析比較后，使用 DNAStar(Verison4.0)和 Primer Premier(Verison5.0)針對(duì)HA基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增包含HA基因的核苷酸片段，所設(shè)計(jì)引物送上海英駿生物有限公司按照PAGE級(jí)別合成。引物序列如下，HA1:AGCAAAAGCAGGGG;HA2:AGTAGAAACAAGGGTGTT，預(yù)計(jì)擴(kuò)增1700 bp。

1.3.2 RT－PCR 反應(yīng) 用 Takara MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取分離株雞胚尿囊液的病毒總RNA，用隨機(jī)引物為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，再用針對(duì)H9亞型禽流感病毒HA基因所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，將RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.3.3 序列測(cè)定和分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)得的序列提交NCBI BLAST SERVER進(jìn)行聯(lián)機(jī)檢索。應(yīng)用DNAStar軟件分析HA蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列、受體結(jié)合位點(diǎn)以及潛在的糖基化位點(diǎn)，并利用 MEGA 5軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。從GenBank上獲得 BJ94、SS、F、SD696 等疫苗毒株以及近年來(lái)流行毒株的HA基因核苷酸序列(表1)，結(jié)合本試驗(yàn)分離株的相應(yīng)序列，利用DNAStar軟件包中的MegAlign程序中Clustal W方法進(jìn)行相似性比較。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和傳代 經(jīng)處理的病料接種10日齡SPF雞胚，96 h內(nèi)均未出現(xiàn)死亡，收獲凍死雞胚尿囊液，無(wú)菌檢查為陰性。

2.2 血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn) 分離株的雞胚尿囊液能凝集雞紅細(xì)胞，表明其對(duì)雞紅細(xì)胞具有血凝性，血凝效價(jià)(HA)為1∶256。而新城疫病毒、減蛋綜合癥病毒和禽流感病毒H5亞型、H7亞型、H9亞型的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)分離株的血凝抑制效價(jià)(HI)分別為 ＜1∶2、＜1∶2、＜1∶2、＜1∶2、1∶256，證明分離到的病毒株為禽流感病毒H9亞型，命名為A/chicken/Guangdong/JL/2014(簡(jiǎn)稱為JL)。

2.3 RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用特異性引物對(duì)JL株的RNA進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得與預(yù)期大小一致的目的片段(圖1)。

2.4 HA基因序列的測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析 序列測(cè)定后，將JL株的HA基因序列經(jīng)NCBI BLAST SERVER檢索，結(jié)果顯示其與GenBank上的RZ853株的核苷酸序列相似性最高，達(dá)到97%。利用DNAStar軟件對(duì)JL株的HA基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明其HA基因含有一個(gè)長(zhǎng)度為1683個(gè)核苷酸的完整ORF，預(yù)計(jì)編碼560個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，當(dāng)中含有8個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，依 次 為:29NST、141NVS、145NGT、298NTT、305NVS、313NCS、492NGT、551NGS。受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸分別為:109Y、161W、163T、191N、198T、202L、203L，即除了198位氨基酸有所變化外，其它位點(diǎn)均很保守;而其226位氨基酸為L(zhǎng)，為哺乳動(dòng)物受體結(jié)合位點(diǎn)的特征氨基酸。裂解位點(diǎn)(335～341位)的氨基酸序列為RSSR↓GLF，裂解位點(diǎn)附近均無(wú)連續(xù)堿性氨基酸插入，僅能被有限的細(xì)胞蛋白酶識(shí)別，符合低致病性禽流感病毒的分子特征［6－7］(表2)。基于JL株與GenBank中的H9亞型禽流感毒株分群參考毒株、國(guó)內(nèi)常用疫苗株以及近年來(lái)流行毒株的HA基因核苷酸序列，利用MEGA5.2軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，JL株屬于4.2.5分支，與RZ853株的親緣關(guān)系最近，與GX55、LG1等近年來(lái)流行毒株處于同一進(jìn)化分支;而國(guó)內(nèi)常用疫苗株F、SS、SD696與BJ94株同屬4.2.3分支。分離的JL株所處的4.2.5分支和SS株等常用疫苗株所處的4.2.3分支同屬4.2這一大分支，但兩個(gè)分支之間有一定的遺傳距離［8－9］。

圖2 分離株的HA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 JL株與各參考毒株HA蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)的比較

2.5 HA基因和蛋白序列相似性分析 利用DNAStar軟件包中的MegAlign軟件對(duì)JL株HA基因核苷酸、蛋白氨基酸序列與GenBank上獲得毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行相似性比較。結(jié)果表明，JL株HA基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列與RZ853株等國(guó)內(nèi)近年流行的4.2.5分支H9亞型禽流感病毒的相似性較高，分別為90.9% ～97%和94.3% ～99.5%，而與國(guó)內(nèi)常用疫苗株 F、SS、SD696 等 4.2.3 分支毒株的相似性較低，分別為88.4% ～89.6%和90.7% ～91.4%。由此可見，同屬4.2 分支的 4.2.5分支(JL株等流行株為代表)和4.2.3分支(SS、F株等常用疫苗株為代表)之間存在了一定的差異。

3 討論

3.1 JL株的分離鑒定 本試驗(yàn)從發(fā)病雞群中分離到JL株，它對(duì)雞紅細(xì)胞有血凝性，而凝集可被H9亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制，測(cè)序結(jié)果分析顯示，JL株的HA蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為RSSR↓GLF，符合低致病性毒株的分子特征，證明JL株為H9亞型禽流感病毒低致病力毒株。

3.2 HA基因分析 裂解位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原位點(diǎn)都位于血凝素HA蛋白中，選用HA基因來(lái)分析H9亞型禽流感病毒的致病性、宿主特異性、抗原性以及遺傳變異等情況，可得到較為可靠的分析結(jié)果。受體結(jié)合位點(diǎn)方面，JL株及近年來(lái)的流行株HA蛋白的第226位氨基酸均發(fā)生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突變，呈現(xiàn)出典型的人流感病毒受體結(jié)合特性，這提示H9亞型禽流感病毒不經(jīng)中間宿主適應(yīng)就能直接感染人類的趨勢(shì)更明顯，在未來(lái)可能對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅［10］。至于潛在糖基化位點(diǎn)，JL株相比 F、SS等疫苗株發(fā)生了 S145N、T220I、P315S等突變，導(dǎo)致缺少 218NRT、增加了145NGT、313NGT潛在糖基化位點(diǎn)。145NGT的出現(xiàn)造成病毒不與抗H9N2的單克隆抗體F6、2A4發(fā)生反應(yīng)，直接導(dǎo)致病毒致病性和抗原性的改變［11］;但其它兩個(gè)突變對(duì)于抗原性有多大影響，目前尚未清晰。基于JL株HA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，JL株屬于4.2.5分支，而國(guó)內(nèi)常用疫苗株F株、SS株、SD696株與BJ94株同屬4.2.3分支，JL株所處的4.2.5分支和疫苗株所處的4.2.3分支雖然同屬4.2這一大分支，但兩個(gè)分支之間有較明顯的遺傳距離和差異。本次分離的JL株和當(dāng)前的流行株類似，均與疫苗株有一定的核苷酸、氨基酸序列以及抗原性差異，當(dāng)前使用的疫苗株不一定能夠提供100%的完全保護(hù)。

3.3 H9的防控 當(dāng)前一些肉雞場(chǎng)有H9亞型禽流感的暴發(fā)和流行，不能夠完全歸結(jié)為毒株變異、抗原性改變而使現(xiàn)有的疫苗不能完全保護(hù)，在多數(shù)情況下可能還與飼養(yǎng)環(huán)境、管理水平、免疫失誤等原因有關(guān)。畢竟商品肉雞生長(zhǎng)周期短，免疫器官發(fā)育尚未成熟，接種滅活疫苗并未能迅速產(chǎn)生有效保護(hù)力，加上滅活疫苗主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生循環(huán)抗體，免疫雞群可能缺乏足夠的分泌型抗體，從而對(duì)粘膜的保護(hù)效果較低。如果飼養(yǎng)環(huán)境差，病原復(fù)雜，管理水平低，應(yīng)激因素多，均會(huì)加重疫情。因此，要結(jié)合隔離、消毒等生物安全措施以及規(guī)范飼養(yǎng)管理來(lái)綜合防治，并適當(dāng)結(jié)合應(yīng)用有效的優(yōu)質(zhì)滅活苗(含有4.2.5分支毒株)進(jìn)行補(bǔ)免，這有可能減少H9亞型禽流感的發(fā)生，或者降低其危害。

［1］甘孟侯.禽流感(第二版)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004:1－91.

［2］盧受升，高慧敏，丁紅星，等.廣東地區(qū)今年H9亞型禽流感的HA基因的序列分析［J］.南粵動(dòng)物防疫，2014，(4):23－27.

［3］張曉娟，劉媛媛，王俊亞，等.河南部分地區(qū)H9亞型禽流感病毒的分離鑒定及交叉免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(26):67－70.

［4］GB/T 18936－2003，高致病性禽流感診斷技術(shù)［S］.

［5］殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.第二版.北京:科學(xué)出版社，1997:262－264.

［6］Rohm C，Horimoto T，Kawaoka Y，et al.Do hemagglutinin genes of highly pathogenic avian influenza virus constitute unique phylogenetic lineages?［J］.Virology，1995，209(2):664－670.

［7］Lin Y P，Shaw M，Gregory，et al.Avian－to－h(huán)uman transmission of H9N2 subtype influenza a virus:relationship between H9N2 and H5N1 human isolates［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:9654－9658.

［8］尚飛雪，劉 爍，蔣文明，等.近年來(lái)中國(guó)H9亞型禽流感分離株譜系分析［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012，29(4):51－53.

［9］Wenming Jiang，Shuo Liu，Guangyu Hou，et al.Chinese and Global Distribution of H9 Subtype Avian Influenza Viruses［J］.PLOS ONE，2012，7(12):1－8.

［10］陳瑞愛，賴漢漳，賀東生，等.20株雞源H9N2亞型禽流感病毒HA基因的變異分析［R］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2012:22.

［11］陳 陸，鄭鹿平，趙 軍，等.H9N2亞型禽流感病毒HA蛋白S145N變異株致病性及抗原特性［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43(1):82－89.