RIP140/PGC-1α在AngII調節(jié)心肌能量代謝中的作用研究

陳艷芳，劉培慶

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院藥學部，廣東廣州 510260;2.中山大學藥學院，廣東廣州 510006)

血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)通過調節(jié)血管收縮在高血壓、心肌肥厚和心室重構等病理過程中起關鍵作用。近年來，研究發(fā)現［1-2］，AngⅡ對衰竭心臟的心肌能量代謝調節(jié)也產生了不利影響，通過降低心肌能量代謝的效率，減弱心臟收縮功能，從而加劇衰竭心臟左室重構的進展。然而，當前研究對于AngⅡ影響心肌能量代謝的機制并不明確。受體相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140，RIP140)和過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子1α(PPARγ coactivator-1α，PGC-1α)是調控心肌能量代謝的重要轉錄輔助因子，本文以乳鼠心肌細胞為研究對象，探討RIP140與PGC-1α在AngⅡ調節(jié)線粒體產能中的作用，為確定RIP140與PGC-1α作為調控心肌能量代謝新靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);蛋白電泳儀、電轉儀、GEL DOC 2000成像系統(tǒng)、蛋白定量酶標儀(美國BioRad公司);RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量分析試劑盒(日本TaKa-Ra);發(fā)光液、核蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司);胎牛血清(美國Hyclone公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);RIP140抗體(英國Abcam公司);AngⅡ、胰蛋白酶、histone(美國Sigma);PGC-1α抗體(Calbiochem);RIPA蛋白裂解液(南京碧云天生物技術有限公司);ATP含量測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥有限公司)。

1.2乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)取出生后1～2 d SD大鼠，開胸取出心臟，用PBS沖洗后將心臟剪成1 mm3左右小塊。瞬時離心后棄去上清，加入15 mL 0.08%的胰蛋白酶于37℃水浴消化5 min。收集上清至等量含15%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基中，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清。沉淀用含1～2 mL胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞。剩余未消化的組織塊繼續(xù)加入胰酶消化，如此重復5～6次直至組織塊呈白色為止。最后，離心收集總的細胞沉淀，重懸，接種細胞于培養(yǎng)瓶中。置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h，收集培養(yǎng)瓶中富集心肌細胞的懸液，計數種板，并在培養(yǎng)基中加入0.1 mol·L-1的BrdU抑制成纖維細胞的生長。

1.3Western blot分析利用核蛋白試劑盒提取心肌細胞核蛋白，考馬斯亮藍定量后分裝50 μg蛋白留作上樣。配置8%的分離膠和5%的濃縮膠，70 V下分離30 min，于120 V電壓下繼續(xù)電泳至溴酚藍到達分離膠底部。220 mA恒流電轉90 min，用5%牛奶室溫封閉1 h，然后加入RIP140(1∶1 000稀釋)、PGC-1α(1 ∶800稀釋)等抗體，4℃孵育過夜。二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，洗膜后于暗室下加入生物發(fā)光液顯影、定影。采用GEL DOC 2000成像系統(tǒng)、Quantity one軟件對條帶進行灰度分析，以組蛋白histone為內參蛋白作為對照。

1.4心肌細胞線粒體ATP濃度測定螢火蟲熒光素酶能催化ATP依賴性熒光素的氧化，經過電子轉移，將化學能轉化為氧化型熒光素的光能，利用生物發(fā)光儀(檢測波長560 nm)進行檢測，所測得的熒光RLU值與ATP的含量呈線性正相關。將試劑盒中的 ATP 標準溶液稀釋為 0.5、2、10、50 和 100 μmol·L-1五個濃度梯度，以縱坐標為ATP濃度，橫坐標為熒光RLU值繪制ATP濃度標準曲線。取待測的細胞，按照線粒體分離試劑盒的分離方法，提取細胞活性線粒體，根據測得的熒光RLU值，按ATP濃度標準曲線對其進行定量。

1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析，結果用±s表示。兩均數比較用t檢驗，多組均數比較采用One-way ANOVA檢驗。

2 結果

2.1AngⅡ抑制乳鼠心肌細胞線粒體ATP的生成原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞給予AngⅡ處理12、24、36或48 h后，分別提取活細胞線粒體并測定ATP濃度，觀察AngⅡ對線粒體能量生成的影響。100 nmol·L-1AngⅡ刺激心肌細胞12、24 h后，線粒體ATP濃度均未發(fā)生改變。刺激36 h后，線粒體ATP的水平較對照組明顯下降(P＜0.01)，刺激48 h后ATP含量有進一步下降的趨勢(P＜0.01)(Fig 1B)。未給予AngⅡ處理的心肌細胞，連續(xù)培養(yǎng)12、24、36或48 h，線粒體ATP的濃度均未發(fā)生改變(Fig 1A)。以上結果表明，100 nmol·L-1AngⅡ能明顯抑制心肌細胞線粒體產生ATP，且ATP含量的變化呈時間依賴性下降。

2.2AngⅡ誘導RIP140基因表達同時抑制PGC-1α基因表達RIP140與PGC-1α是調控線粒體產能的重要輔助因子，兩者在心肌細胞中均有表達，有共同的下游靶基因，但執(zhí)行相反的轉錄功能。兩者通過與核受體或轉錄因子結合(比如PPARs、ERRs、NRFs家族等)，調控脂肪酸、葡萄糖代謝過程中相關酶的表達，在維持線粒體能量平衡中扮演重要角色。為進一步明確AngⅡ介導的心肌產能下降是否與RIP140、PGC-1α相關，我們觀察了 AngⅡ對RIP140、PGC-1α基因的 mRNA、蛋白水平的影響。心肌細胞給予100 nmol·L-1AngⅡ處理36 h后，RIP140的mRNA水平明顯升高(P＜0.01)，而PGC-1α的水平明顯下降(P＜0.01)(Fig 2)。利用Western blot測定兩者的蛋白水平變化，發(fā)現AngⅡ處理組的RIP140蛋白水平較對照組升高了87%(P＜0.01)，而PGC-1α的水平則降低了54%(P＜0.01)(Fig 3)，RIP140、PGC-1α的蛋白變化與各自的mRNA水平變化一致。上述結果表明，AngⅡ誘導RIP140表達升高的同時抑制PGC-1α的表達。

Fig 1 Changes of mitochondrial ATP contents in cardiomyocytes

2.3RIP140與PGC-1α基因介導AngⅡ對線粒體ATP生成的影響為驗證RIP140與PGC-1α基因是否參與了AngⅡ對心肌能量代謝的抑制作用，借助腺病毒系統(tǒng)，使乳鼠心肌細胞外源性過表達RIP140(腺病毒感染滴度MOI=100)或PGC-1α蛋白(腺病毒感染滴度MOI=100)，觀察各處理組線粒體ATP含量的變化。如Fig 4所示，與對照組相比，100 nmol·L-1AngⅡ刺激心肌細胞36 h后，線粒體ATP的含量下降40%(P＜0.01)。心肌細胞給予100 nmol·L-1AngⅡ處理的同時再過表達RIP140，線粒體ATP含量較僅給予AngⅡ處理組有進一步下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而給予AngⅡ處理同時過表達PGC-1α的心肌細胞，線粒體ATP含量較僅給予AngⅡ處理組相比明顯升高，但仍低于對照組水平(P＜0.05)。說明心肌細胞過表達RIP140促進AngⅡ介導的心肌線粒體產能進一步下降，過表達PGC-1α則減輕了AngⅡ對心肌線粒體產能的抑制作用。RIP140與PGC-1α共同參與了AngⅡ對心肌細胞線粒體產能的影響。

Fig 2 mRNA levels of RIP140 and PGC-1α after AngⅡ treatment

Fig 3 Protein levels of RIP140 and PGC-1α after AngⅡ treatment

3 討論

RIP140與PGC-1α是調控機體能量貯存和利用、線粒體生成的重要的轉錄輔抑制因子和轉錄輔激活因子［3］。二者在調控心臟能量代謝平衡，維持心臟正常的形態(tài)和功能方面發(fā)揮著重要的作用。PGC-1α作為轉錄輔激活因子，促進核受體/轉錄因子介導的代謝相關基因的轉錄及線粒體生成，可以激活與脂肪酸的攝取、氧化和氧化磷酸化緊密相關的多種代謝基因，被認為是糾正衰竭心臟能量紊亂的新靶點［4］。心肌細胞過表達 PGC-1α，可誘導與脂肪酸轉運、利用及β氧化過程密切相關基因的表達，同時線粒體的耗氧速率也明顯增加［5］。受體相互作用蛋白RIP140為轉錄輔抑制因子，與PGC-1α的功能恰恰相反，能明顯抑制脂肪［6］、骨骼肌［7］、心臟［8-9］等代謝組織的分解代謝。其與核受體結合后能夠負向調節(jié)多種代謝組織中靶基因的轉錄。RIP140與PGC-1α表達的失衡可能是導致心肌能量代謝紊亂，進而加劇心力衰竭病程的重要因素。

Fig 4 Change of ATP contents in AngⅡtreated cardiomyocytes after overexpressing RIP140 or PGC-1α

本研究發(fā)現RIP140與PGC-1α在AngⅡ抑制心肌產能過程中扮演重要角色。AngⅡ誘導乳鼠心肌細胞線粒體生成ATP的能力下降，促進轉錄輔抑制因子RIP140的表達，而抑制轉錄輔激活因子PGC-1α表達。借助腺病毒過表達載體，在AngⅡ處理的同時進一步過表達RIP140或PGC-1α，結果發(fā)現，過表達RIP140后促進AngⅡ對線粒體ATP的抑制作用，而過表達PGC-1α則能改善AngⅡ對心肌細胞線粒體產能的影響。說明AngⅡ對ATP生成的變化影響受RIP140和PGC-1α的共同調節(jié)，同時也進一步驗證了RIP140與PGC-1α在維持心肌能量代謝平衡調節(jié)上的作用是相反的。此外，本研究借助腺病毒載體外源性過表達RIP140和PGC-1α蛋白，克服了原代培養(yǎng)的心肌細胞存在過表達效率低等問題，確保了研究結果的可信度。

心臟能量代謝是心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病的研究熱點，糾正心肌能量代謝重構有望成為開辟心力衰竭等疾病的治療的新向導［10，11］。筆者推測心臟能量代謝平衡的調控很可能取決于這些轉錄輔助因子的相對表達水平和活性，RIP140與PGC-1α表達的失衡很可能是心肌能量代謝紊亂的重要影響因素。但是，心肌能量代謝的過程是錯綜復雜的，多種核受體、轉錄因子調控的代謝基因參與心肌能量代謝過程，該研究明確了 AngⅡ誘導RIP140表達升高與PGC-1α表達下調，從而影響線粒體ATP生成，這一發(fā)現目前國內外尚無文獻報道。而對于AngⅡ在調控RIP140與PGC-1α表達變化后是通過何種核受體或轉錄因子調控還有待進一步深入研究。通過闡明RIP140和PGC-1α在AngⅡ介導心肌能量代謝影響的作用研究，將AngⅡ調節(jié)的RAS系統(tǒng)與心肌能量代謝紊亂聯系起來，這對了解高血壓、心肌肥厚等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機制具有重要的意義，為了解心肌能量代謝紊亂發(fā)生、發(fā)展機制提供了理論依據，也為進一步找尋調控心肌能量代謝的靶點開拓了思路。

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