地錦草對移植性肝癌H22小鼠抑瘤率和免疫功能的影響

王曉敏 高增光 鄒志堅(江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

清熱解毒中藥地錦草具有體內抗腫瘤、體外誘導腫瘤細胞凋亡的作用，但其機制尚不清楚〔1，2〕。本實驗以小鼠H22移植性實體瘤為模型，觀察地錦草水提液對移植性肝癌H22小鼠的抑制作用及免疫功能影響，探討地錦草的體內抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 H22腹水瘤小鼠(中科院細胞庫提供);昆明種近交系雄性小鼠，SPF級，體重(28±2)g，江西中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號SXCK(贛)2011-0001。

1.2 藥物與儀器 地錦草:購自毫州市永剛飲片廠有限公司，經江西中醫藥大學中藥組鑒定為Euphorbiae humifusae herba，環磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號12060125)。小鼠酶聯免疫(ELISA)白介素(IL)-2測試盒(上海西唐生物科技有限公司批號20120712)。電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多，0.001g)。UV-2102紫外分光光度計(尤尼柯儀器有限公司);切片機和脫水機(徠卡)，徠卡DL2500顯微鏡(德國徠卡);徠卡CCD圖像采集系統(德國徠卡)。

1.3 造模、分組及給藥 將接種H22瘤種7 d的腹水瘤小鼠以脫頸法處死，無菌條件下抽取腹水瘤細胞懸液5 ml經離心稀釋，用生理鹽水重新懸浮細胞，細胞懸液濃度為1×106/ml。以每只0.2 ml接種于60只昆明種小鼠右腋下，制成實體瘤動物模型〔3〕。接種24 h后，分別隨機分成5組，每組12只。低、中、高劑量組、陽性對照組和模型組。分別灌胃不同劑量的地錦草低、中、高劑量組按照(66、132、265 mg·kg-1·d-1)劑量灌胃2 w，陽性對照組按照50 mg·kg-1·d-1尾靜脈注射1次，模型組和陽性對照組小鼠灌胃給予生理鹽水0.8 ml，連續2 w。

1.4 抑瘤率 給藥后14 d稱重后處死小鼠，嚴格剝離干凈皮下腫瘤組織和脾臟使用電子秤稱重，計算各組脾臟指數和腫瘤抑制率。

1.5 血清IL-2的測定 離心分離血清，按試劑盒說明采用ELISA法進行檢測。

1.6 腫瘤細胞形態學的觀察 瘤體固定在10%甲醛中做石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察細胞形態。

2 結果

2.1 地錦草對移植性肝癌H22小鼠生長的影響 用藥后高劑量地錦草與陽性對照組對移植實體瘤均有明顯抑制作用。高劑量地錦草組瘤重量較模型組明顯縮小(P＜0.05)，但其抑制作用不如陽性對照組;低劑量和中劑量地錦草組與模型組比較無統計學差異(P＞0.05)。與模型組比較，高劑量與陽性對照組的抑制率明顯上升(P＜0.01)，但中劑量和低劑量無統計學差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組移植性肝癌H22瘤重及抑瘤率比較(x ± s，n=10)

2.2 地錦草對移植性肝癌H22小鼠脾指數和血清IL-2的影響 用藥后地錦草與陽性對照組小鼠脾指數均有升高，但地錦草組與模型組比較無統計學差異(P＞0.05)，其抑制作用不如陽性對照組。地錦草與陽性對照組小鼠血清IL-2均有升高，高、中、低劑量地錦草組與模型組比較有顯著差異(P＜0.05);見表2。

表2 各組移植性肝癌H22小鼠脾指數和血清IL-2比較(x ± s，n=10)

2.3 組織形態學變化 模型組瘤區腫瘤細胞部分呈橢圓或圓形，胞核大深染，病理性核分裂象多見，核質比增大，有明顯的異型性，細胞排列成團塊狀。地錦草組和陽性對照組腫瘤細胞數量明顯減少，可見明顯的核固縮和核碎裂;部分瘤組織內有不同程度的壞死呈紅染區及淋巴細胞浸潤，以高劑量組最為顯著。見圖1。

圖1 各組腫瘤的形態(HE，×20)

3 討論

中醫學認為熱毒是惡性腫瘤發生、發展的重要原因之一。如《靈樞·百病始生篇》云“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣。”和明·徐春圍在《古今醫統》中亦指出“氣血日虧，相火漸熾，幾何不致噎膈。”即熱邪久留體內，血遇熱則凝，津液遇火灼為痰，熱與痰、瘀等蘊結形成熱毒，熱毒阻塞于經絡臟腑形成腫瘤〔4〕。且腫瘤的機械壓迫致使臟器血管受壓或梗阻，造成臟器功能失調及血循環障礙，容易發生感染。炎癥或感染往往是促使腫瘤惡化和發展的因素之一。清熱解毒中藥能控制和消除腫瘤及其周圍的炎癥和水腫，臨床上常使用清熱解毒藥物治療腫瘤，阻止腫瘤發展〔5，6〕。如清熱解毒中藥白花蛇舌草可使癌細胞有絲分裂象受到顯著的抑制，使癌組織變性壞死〔7，8〕。本研究觀察給予清熱解毒中藥地錦草后瘤重明顯減輕，抑制率升高，且光學顯微鏡下腫瘤細胞數明顯減少，出現核深染、異形細胞減少，固縮和死亡的腫瘤細胞增多，淋巴細胞浸潤增多的形態學變化，提示地錦草能夠抑制腫瘤細胞的生長。脾臟的臟器系數是衡量機體免疫功能的初步指標〔9〕，IL-2是參與免疫應答的重要細胞因子，并參與抗腫瘤效應和移植排斥反應。IL-2促進T細胞激活，增強T細胞殺傷活性，延長T細胞在體內時間，同時還可以誘導T細胞產生IFN-γ、TNF等細胞因子，增強機體殺傷腫瘤細胞能力〔10〕。本實驗結果顯示地錦草能提高脾指數、增加血清IL-2的水平，推測這是地錦草提高機體的免疫力來抑制腫瘤細胞生長機制之一。現代藥理學研究證明地錦草的抗炎、抗真菌及調節免疫作用與黃酮、三萜、香豆素、甾醇、鞣質及酚酸類等化合物的有效成分有關〔11〕。地錦草提高機體免疫力來抑制癌細胞生長的具體成分有待深入研究。

1 瑋 罕，耿果霞，李青旺，等.地錦草抗宮頸癌活性研究〔J〕.中國畜牧獸醫，2010;37(3):192-4.

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3 劉海軍，孫晉民，賈蘭玲.杜香提取物抑制荷瘤H22小鼠生長的實驗研究〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(19):3743-4.

4 李 超，樊巧玲.從“毒邪”論治惡性腫瘤〔J〕.山西中醫學院學報，2012;13(3):134-5.

5 劉磊磊，陳娟，師彥平.清熱解毒中藥抗腫瘤作用研究進展〔J〕.中草藥，2012;43(6):1203-12.

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7 胡 玲，王洪琦，成曉燕，等.白花蛇舌草對H22肝癌細胞熱休克蛋白70表達的影響〔J〕.廣州中醫藥大學學報，2007;24(1):44-6.

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9 湯小軍，黃建春，黃仁彬，等.六月青多糖對S180荷瘤小鼠免疫功能及 p53，Bcl-2，Bax表達的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2013;19(4):250-4.

10 Weiss JM，Back TC，Anthony J，et al.Successful immunotherapy with IL-2/anti-CD40 induces the chemokine-mediated mitigation of an immunosuppressive tumor microenvironment〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2009;106(46):19455-60.

11 李治建，古力娜·達吾提，斯拉甫·艾白.維藥地錦草的研究進展〔J〕.中國民族醫藥雜志，2008;8(8):15-21.