前腦啡肽和前強啡肽在慢性應激大鼠腦內的表達

趙心宇 陳 曦 王佳琪 劉思禹 閆 宇 鄭思涵 劉純青

(大連醫科大學檢驗醫學院，遼寧 大連 116044)

抑郁癥患者腦內主要的病理生理學改變為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)亢進。除了下丘腦，很多其他腦區，如前額葉皮層、海馬、皮層、杏仁核、伏隔核均介入了抑郁癥發病機制。腦啡肽及強啡肽與神經系統關系最為緊密。已有一些動物實驗發現阿片肽與應激和焦慮關系密切，但目前對這兩種阿片肽的研究多集中在與焦慮、恐懼密切相關的杏仁核和伏隔核，對于其他腦區的研究尚未見報道。本研究通過檢測前額葉皮層、海馬、紋狀體和下丘腦區4個腦區內這兩種阿片肽的前體蛋白——前腦啡肽(PENK)/前強啡肽(PDYN)的表達變化，以明確這些腦區是否也存在阿片肽的變化和參與慢性應激的調節過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性Wistar大鼠22只，體重220～250 g，購自大連醫科大學動物實驗中心。

1.2 慢性應激動物模型的建立 動物購買后適應1 w，5～6只為一籠，自由食水，晝夜各12 h，室溫保持在20℃左右。從22只動物中隨機選取12只為模型組，其余10只為對照組。模型組所有動物均單籠飼養。將5個日相刺激(束縛、40℃熱刺激、200 r/min陣 in搖、夾尾，游泳)、6個夜相刺激(傾斜籠子45°、濕籠、社會接觸、空籠、夜閃、噪音)和2個全天刺激(禁食水和晝夜顛倒)隨機安排到1 w內，連續刺激6 w，每周各種刺激順序隨機重新組合。對照組每5只大鼠合籠飼養，自由食水，整個實驗過程中不接受任何刺激。

1.3 行為學檢測 于造模前1 d和造模后的第3天進行稱重、糖水偏愛實驗和高架十字迷宮的檢測。糖水偏愛實驗:先進行糖水偏愛實驗訓練，即禁食水24 h后給動物1%的葡萄糖水飲用，讓動物熟悉糖水的味道。下一次訓練中，禁食水后同時給動物提供糖水和自來水，經過2～3次訓練，動物即可學會飲用糖水。檢測時記錄動物4 h內飲用糖水和自來水的量。高架十字迷宮:先將動物置于迷宮中適應10 min，正式實驗時記錄5 min內動物在暗臂內停留的時間。一只動物實驗結束后，以50%乙醇擦拭高架迷宮，防止氣味對下一只大鼠的行為造成影響。

1.4 熒光定量PCR檢測 行為學檢測后次日將所有動物斷頭取腦，分離前額葉皮層、紋狀體、海馬和下丘腦。新鮮組織勻漿后，應用Trizol法(購自ambion公司)提取總RNA，瓊脂糖電泳鑒定總RNA質量，并應用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。反轉錄和Real-time PCR擴增按照試劑盒說明書(購自大連寶生物公司)操作，每個樣本取總RNA約1 000 ng，依次加入PrimeScript Buffer、逆轉錄酶、隨機引物和Oligo dT引物，配制成20μl反應體系，37℃ 15 min和85℃ 5 s條件下逆轉錄成cDNA。

根據Gene Bank的序列，由大連寶生物公司設計和合成PENK、PDYN及內參GAPDH的引物。引物序列如下:PENK-正義:5'-TGGCTACAGTGCAGGCAGA-3'，PENK-反 義:5'-TTGTACATGTCGATGTTATCCCAAG-3';PDYN-正 義:5'-GGAGAACCCCAATACCTATTCCG-3'，PDYN-反 義:5'-GGTCTCCTGGATTCTAGGGTGG-3';GAPDH-正義:5'-TCCCATTCTTCCACCTTTGA GCT-3'，GAPDH-反義:5'-ACCCTGTTGCTGTAGGCCATATTCAT-3'。將反轉錄產物、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ及上述上、下游引物配成25 μl反應體系，95℃ 30 s;95℃ 5 s，62℃ 30 s，40 個循環條件下進行Real-time PCR擴增，記錄各樣本Ct值。

1.5 統計學分析 應用SPSS11.0軟件行獨立樣本的t檢驗。

2 結果

2.1 行為學檢測結果 造模前(第0周)兩組動物在體重、糖水偏愛實驗和高架十字迷宮的檢測中，成績無明顯差異(P＞0.05)。造模后的第6周，與對照組比較，慢性應激組大鼠體重明顯降低(P＜0.01);對糖水的攝入量也明顯減少(P＜0.01);且停留在暗臂的時間也明顯延長(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組動物行為學檢測結果(±s)

表1 兩組動物行為學檢測結果(±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

時間 組別 n 體重(g)糖水偏愛實驗(%)高架十字迷宮(s)10 257±22 0.53±0.20 174±41應激組 12 252±23 0.59±0.18 168±46第6周 對照組 10 334±25 0.89±0.08 241±19應激組 12 283±292) 0.77±0.111) 266±251)第0周 對照組

2.2 Real-time PCR實驗結果 檢測的4個腦區中前額葉皮層和下丘腦存在明顯變化(P＜0.05)，而海馬和紋狀體則無明顯變化(P＞0.05)。慢性應激第6周，前額葉皮層中PENK表達明顯降低，為對照組的0.4倍;與之相反，PDYN的表達增加至對照組的3.5倍。下丘腦的檢測結果與前額葉皮層相似，PENK的表達明顯降低，為對照組的0.3倍;而PDYN的表達增加至對照組的2.6倍。

3 討論

抑郁癥的病因錯綜復雜、癥狀多樣、發病機制尚不完全清楚。目前國內外廣泛認為長期處于應激狀態是人類形成焦慮和抑郁的主要內在驅動力，也是抑郁癥的發病基礎，故對抑郁癥的科學研究普遍應用慢性應激動物模型。其中，慢性輕度不可預見性應激模型(CUMS)是目前最接近人類抑郁癥發病機制的理想模型。本實驗參考前人的造模方法〔1〕并略加修改，整個刺激過程無動物死亡，至第6周，應激組大鼠較對照組僅表現出體重減輕約30%，說明該方法屬于輕-中等程度的刺激。除體重降低外，蔗糖偏愛和高架十字迷宮實驗結果，也提示本實驗所采用的慢性刺激可成功地誘導出動物的抑郁樣癥狀。

人們早就熟知阿片類藥物既有強大的鎮痛作用，又可引起明顯的欣快感，也因此具有成癮作用。早有研究表明內源性阿片肽在正常情感和情緒的維持中起重要作用，這也提示阿片肽很可能與情緒障礙疾病(如抑郁癥)密切相關。每一類阿片肽都由一種特定的前體分子衍化而來，本實驗中檢測的PENK和PDYN即為兩種阿片肽前體分子，其中PENK可衍生為甲硫氨酸腦啡肽(Met-ENK)和亮氨酸腦啡肽(Leu-ENK);PDYN又可衍生為強啡肽A、強啡肽B及α新內啡肽。

已有研究顯示腦啡肽和強啡肽在抑郁癥動物模型中存在改變。Bérubé等〔2〕應用原位雜交技術發現慢性社會挫敗抑郁癥動物杏仁核內PENK mRNA表達降低，而伏隔核的背側及內側PDYN mRNA表達增加。Kung等〔3〕研究發現腦啡肽基因敲除小鼠對傷害性刺激(如足底電擊)表現得更加敏感，在惡性刺激影響下更容易出現焦慮和抑郁，提示腦啡肽存在穩定情緒的作用。與此研究類似，Poulin等〔4〕最近的一項研究發現慢性束縛應激大鼠伏隔核內的PENK mRNA表達較對照組也呈現明顯的降低，而且其降低程度與糖水偏愛實驗結果呈正相關，PENK mRNA降低程度越明顯的動物，其飲用糖水量也越少。Bérubé等〔5〕應用病毒載體特異性地敲除動物杏仁核內腦啡肽的表達同樣可引起動物焦慮和抑郁的行為學表現。上述3篇文獻一致揭示腦啡肽通過杏仁核及伏隔核介入到以慢性應激為基礎的抑郁癥發病機制中，其在抑郁癥中表達降低很可能是動物出現焦慮及抑郁癥狀的病理基礎，反過來也提示腦啡肽及其受體激動劑很可能成為治療抑郁癥的藥物。

與腦啡肽相反，Shirayama等〔6〕應用免疫組化法觀察到習得性無助抑郁樣大鼠伏隔核和海馬內強啡肽A和強啡肽B免疫反應活性均增強，Lucas等〔7〕則應用原位雜交法在慢性束縛應激抑郁樣大鼠紋狀體和伏隔核內觀察到κ受體的表達增加，提示強啡肽-κ受體系統在慢性應激為基礎的抑郁癥中處于活性上調的狀態。為證實抑郁行為中強啡肽表達上調的意義，Chartoff等〔8〕發現抑郁樣大鼠服用抗抑郁藥不但可以緩解其抑郁行為，也降低了伏隔核內強啡肽的表達，而且強啡肽基因敲除小鼠也較對照組表現出相對輕的抑郁樣狀態。因此，慢性應激過程中強啡肽及其受體表達增加介入了抑郁樣行為表現，這提示κ受體拮抗劑很可能成為能夠減輕抑郁樣行為的藥物。實際上Carr等〔9〕已經通過實驗證實該想法，他們觀察到一種κ受體拮抗劑(DIPPA)可減輕WKY和SD大鼠的焦慮癥狀，該研究不但進一步明確強啡肽在抑郁癥中的作用，作為一種臨床前探索也為抑郁癥或焦慮癥的藥物治療提供理論依據。

盡管上述研究詳細闡明了腦啡肽/強啡肽在抑郁癥中的作用，這些研究多局限在動物腦內杏仁核及伏隔核，但前額葉皮層、海馬、基底節及下丘腦等腦區也均與抑郁癥密切相關。很多研究顯示抑郁癥病人額葉背側區、前扣帶回膝下部皮質厚度減低，腦PET研究顯示海馬區糖代謝減低，基底神經節，特別是尾狀核功能活動減弱。另有磁共振研究發現抑郁癥患者前額葉皮層體積減小并與疾病嚴重程度有關，尸檢研究顯示下丘腦內胺類神經遞質紊亂，促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)陽性神經元數目增多〔10〕。這些研究均提供有力證據證實這些腦區在抑郁癥發病機制中的重要作用。本實驗發現慢性應激大鼠前額葉皮層和下丘腦內PENK表達降低，而PDYN表達增加，這與上述杏仁核及伏隔核的變化一致，紋狀體和海馬內這兩個指標則無明顯變化，說明同伏隔核及杏仁核一樣，前額葉皮層和下丘腦內的阿片肽也參與了慢性應激為基礎的抑郁癥的發病機制。

阿片肽及其受體廣泛地表達在各個腦區，腦啡肽和強啡肽在前額葉皮層和下丘腦具有很活躍的調節作用，本研究首次在抑郁癥大鼠模型中也證實了這個假設，提示額葉皮層和下丘腦內的阿片肽很可能參與了抑郁癥的情緒調節機制。但額葉皮層和下丘腦也包含多個核團，每個核團也受多種神經遞質調節，故筆者觀察到的變化在抑郁癥中究竟具有何種地位及意義還需要進一步實驗證實。

1 許 晶，李曉秋.慢性應激抑郁模型的建立及其評價〔J〕.中國行為醫學科學，2003;12(1):14-7.

2 BérubéP，Laforest S，Bhatnagar S，et al.Enkephalin and dynorphin mRNA expression are associated with resilience or vulnerability to chronic social defeat stress〔J〕.Physiol Behav，2013;122(3):237-45.

3 Kung JC，Chen TC，Shyu BC，et al.Anxiety and depressive-like responses and c-fos activity in preproenkephalin knockout mice:oversensitivity hypothesis of enkephalin deficit-induced posttraumatic stress disorder〔J〕.J Biomed Sci，2010;17(1):29.

4 Poulin JF，Laforest S.Enkephalin downregulation in the nucleus accumbens underlies chronic stress-induced anhedonia〔J〕.Stress，2014;17(1):88-96.

5 BérubéP，Poulin JF，Laforest S，et al.Enkephalin knockdown in the basolateral amygdala reproduces vulnerable anxiety-like responses to chronic unpredictable stress〔J〕.Neuropsychopharmacology，2014;39:1159-68.

6 Shirayama Y，Ishida H，Iwata M，et al.Stress increases dynorphin immunoreactivity in limbic brain regions and dynorphin antagonism produces antidepressant-like effects〔J〕.J Neurochem，2004;90:1258-68.

7 Lucas LR，Dragisic T，Duwaerts CC，et al.Effects of recovery from immobilization stress on striatal preprodynorphin-and kappa opioid receptormRNA levels of the malerat〔J〕.Physiol Behav，2011;104(5):972-80.

8 Chartoff EH，Papadopoulou M，MacDonald ML，et al.Desipramine reduces stress-activated dynorphin expression and CREB phosphorylation in NAc tissue〔J〕.Mol Pharmacol，2009;75(7):704-12.

9 Carr GV，Lucki I.Comparison of the kappa-opioid receptor antagonist DIPPA in tests of anxiety-like behavior between Wistar Kyoto and Sprague Dawley rats〔J〕.Psychopharmacology(Berl)，2010;210(3):295-302.

10 周江寧.前額葉皮質與下丘腦在抑郁癥發病中的作用〔J〕.安徽醫科大學學報，2001;36(4):247-50.