應用SE-μPADs法檢測庫爾勒市動物源食品中沙門菌的效果評價

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(1.新疆農業大學動物醫學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆庫爾勒市畜牧獸醫站,新疆庫爾勒市 841000)

沙門菌是一種能嚴重威脅到人類健康的食源性致病菌之一,人如果食用了被一定濃度沙門菌污染的食物會引起中毒,導致傷寒、腸熱癥、敗血癥、胃腸炎等疾病[1]。根據美國疾病控中心的統計數據顯示[2-3],每年在美國由沙門菌引發的食源性疾病常常居于食源性疾病的前列,從2006年到2017年,沙門菌占所有食源性疾病爆發的53.4%,自2008年以來,歐洲確診感染沙門菌病病例呈逐漸下降的趨勢,但腸炎沙門菌感染的比例在不斷增加。在中國,每年由沙門菌造成的食物中毒事件層出不窮,因此建立有效、快速的檢驗方法對于預防和控制沙門菌病十分重要。

目前,沙門菌的檢測方法較多,比較傳統的是國家標準方法檢測沙門菌,其中分子生物學、免疫學等方法的發展大大提高了沙門菌檢測靈敏度,縮短了檢測時間,簡化了檢測程序[4],但對操作人員以及環境要求較高,血清易產生交叉反應而造成假陽性或假陰性,在檢測時間上不能適應疫情發生時的快速檢測。近年來,隨著畜禽產業的發展及動物性食品的增多,沙門菌的快速檢測也隨之重要起來。微流紙基分析裝置(microfluidic paper-based analytical devices,μPADs)技術利用酶-底物法來減少操作步驟,縮短檢測時間。前期研究得到E.coli+S.en-μPADs快速檢測裝置并申請專利[5]。沙門菌微流紙基分析裝置(Salmonellamicrofluidic paper-based analytical devices SE-μPADs)能滿足上述快速檢測的要求,但效果還有待評價,本實驗分別用SE-μPADs快速檢測方法與國家標準方法對庫爾勒市某市場及屠宰場中的不同動物源(雞、牛、羊)的胴體拭子、肛拭子、操作工具、肉樣進行沙門菌的檢測,為SE-μPADs快速檢測試紙的推廣提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

營養瓊脂(nutrient agar,NA)、營養肉湯(nutrient broth,NB)、蛋白胨緩沖液(buffered peptone water,BPW)、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(xylose lysine desoxycholate,XLD)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(selenite cystine,SC)、亞硫酸鉍培養基(bismuth sulfite,BS)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(tatrathionate broth,TTB) 青島海博生物技術有限公司;沙門菌顯色培養基 法國科瑪嘉;TAE 北京鼎國昌盛有限公司;Taq MasterMix、DNA Marker Takara;標準腸炎沙門菌CVCC 3762菌株 中國獸醫微生物菌種保藏管理中心;2-Naphthyl caprylate J&K Scientific bvba公司;無水乙醇 天津市致遠化學試劑有限公司;SE-μPADs快速檢測試紙(已申請專利[6]) 本實驗室制備。

LDZX-50 KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SW-CJ-2FD博迅凈化工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;DHP-9162恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;BCD-219D冰箱 青島海爾股份有限公司;PL203電子天平 梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司;ST-98AB多功能振蕩器 北京桑翌實驗儀器研究所;DYCP-31 DN水平電泳槽、DYCP-31 DN穩壓穩流電泳儀 北京市六一儀器廠;GELDOCXR+凝膠成像系統 美國BIO-RAD公司;Canon LIDE220掃描儀 佳能公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 在庫爾勒市某市場及定點屠宰場采集樣本共380份,其中牛羊肉各41份,牛胴體拭子54份、羊胴體拭子67份,操作工具10份,羊肛拭子15份,雞肛拭子152份,采樣方法參照GB 4789.1-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則[7]。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 國家標準方法樣品處理 按照GB 4789.4-2016[7]進行處理。

1.2.2.2 SE-μPADs快速檢測方法的樣品處理 肉樣的處理:無菌稱取5 g新鮮肉樣并剪碎,置于盛有45 mL營養肉湯的錐形瓶中,順時針搖勻,時間為1～2 min,取1 mL的樣品處理液加入9 mL的BPW中,進行密封并放入37 ℃恒溫培養箱內,培養15 h。胴體及操作工具拭子的處理:將采集胴體及操作工具后的拭子進行前增菌處理,取1 mL的樣品處理液加入9 mL的BPW中置于37 ℃恒溫搖床上,以160～180 r/min的轉速培養15 h。

1.2.3 國家標準方法檢測沙門菌 將處理好的樣品分別加入SC與TTB增菌液,并置于37 ℃恒溫搖床上培養18～24 h,再分別接種至XLD、BS瓊脂選擇性培養基上分別培養24、48 h。將疑似菌株接至沙門菌顯色培養基并用水煮法[8]提取菌落DNA,對invA基因和16S rRNA基因進行PCR鑒定,引物序列表如表1所示,并將陽性產物送測序,測序結果在NCBI數據庫與BLAST中的結果比對。invA基因PCR的反應參數為94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min,35個循環。25 μL的反應體系包括10 μL Mix;上下游引物各0.5 μL,模板1 μL,dd·H2O 13 μL。PCR反應體系中陰性對照的模板為1 μL的dd·H2O外;陽性對照的模板為沙門菌標準菌株的DNA。

表1 沙門菌引物序列和擴增長度Table 1 Salmonella primer sequences and amplification length

1.2.4 SE-μPADs檢測方法 將處理好的樣品取1 mL加入盛有5 mL BPW的離心管中,置于37 ℃恒溫搖床上,以180～200 r/min的轉速培養5 h。將富集5 h的菌液滴加至SE-μPADs的點樣區(SE-μPADs為三聯試紙,紙片中央為點樣區,左右兩側為加底物的顯色區),再將SE-μPADs快速檢測試紙放入37 ℃恒溫培養箱,培養1.5 h。每組試驗均設計空白對照,空白對照即為不加菌液的BPW。同時每組均設兩個重復。滴加沙門菌底物的區域滴加固藍B鹽進行顯色反應,反應完成后,觀察SE-μPADs顯色情況,若試紙左右兩側顯色區域與陽性對照一致,顯示紫色,則可判斷為疑似陽性,若顯色區域的顏色未出現紫色(與空白對照組一致為淡粉色)則可初步判定為陰性,并且對SE-μPADs區域用掃描儀進行掃描,用軟件ImageJ 1.4u讀取SE-μPADs快速檢測試紙的灰度值。最終結果判定:若顯色區域的灰度值大于空白對照組的灰度值,則代表檢測結果為檢出沙門菌;若顯色區域的灰度值小于等于空白對照,則代表未檢出沙門菌。SE-μPADs檢測出的疑似沙門菌繼續進行PCR驗證invA基因與16S rRNA基因,同1.2.4。

表3 SE-μPADs檢測結果Table 3 Detection results of SE-μPADs

1.2.5 SE-μPADs陽性符合率(靈敏度)、陰性符合率(特異性)的計算 計算兩種方法的陽性符合率、檢測方法的陽性符合率(靈敏度)及陰性符合率(特異性)是按照衛生統計學[9-10]公式進行計算(表2)。

表2 兩種檢測方法比較Table 2 Comparison of two detection methods

1.3 數據處理

實驗數據用Office 2010 EXCLE軟件進行匯總與處理。

2 結果與分析

2.1 國家標準方法檢測結果

應用國家標準方法GB 4789.4-2016,對380份樣品進行選擇性增菌,然后接至XLD與BS兩種選擇培養基上,選擇帶有典型菌落的共76株菌,接至顯色培養基進行驗證,如圖1,出現紫色菌落的樣品有15株。挑取紫色菌株進行PCR驗證(圖2),有6株為沙門菌,在羊肉中檢出2株,分別在羊胴體、牛胴體、雞肛拭子、操作工具中各檢出1株。

圖1 沙門菌在顯色培養基上的形態Fig.1 Morphology of Salmonella on chromogenic

圖2 沙門菌invA的PCR檢測結果Fig.2 Detection of Salmonella invA by PCR注:1:DL2000 DNA Marker;2:陽性對照;3:陰性對照;4～5:肉樣;6:雞肛拭子;7:羊胴體拭子;8:牛胴體拭子;9:操作工具拭子。

2.2 SE-μPADs快速檢測方法檢測結果

由表3可知,經SE-μPADs法檢測380份樣品后,有25株菌顏色灰度值大于空白對照組的顏色灰度值(圖3),對25株菌按照國家標準方法進行驗證,接種于顯色培養基上并進行PCR鑒定(圖4),結果檢測出10株沙門菌,其中肉樣3株、牛胴體拭子3株、羊胴體拭子1株、操作工具1株、雞肛拭子2株,陽性率為2.63%。

圖3 部分SE-μPADs快速檢測結果Fig.3 Rapid detection results of partial SE-μPADs 注:紙片中間為點樣區,左右兩側圓形為顯色區;1:陽性對照;2:空白對照;3:雞肛拭子;4:胴體拭子。

圖4 SE-μPADs篩出的沙門菌PCR檢測結果Fig.4 Detection of Salmonella invA by PCR of SE-μPADs screening注:1:DL2000 DNA Marker;2:陽性對照;3:陰性對照;4～7:樣品。

2.3 SE-μPADs快速檢測法檢測效果評價

分別根據SE-μPADs檢測方法和國家標準方法的檢測結果,SE-μPADs方法的初篩率為6.58%(25/380),而國家標準方法初篩率為20%(76/380),SE-μPADs方法較國家標準方法初篩率低。SE-μPADs檢測方法與國家標準方法具體檢測結果見表4,根據衛生統計學計算表格中SE-μPADs的陰性符合率(特異性)94.92%、陽性符合率(靈敏度)為100%。

表4 SE-μPADs和國家標準方法的比較Table 4 Comparison of the SE-μPADs and the national standard methods

2.4 庫爾勒市沙門菌的污染情況

同時應用兩種方法對380份樣本進行檢測,結果顯示,SE-μPADs檢測方法和國家標準方法檢測出沙門菌10株,由表3可以看出,總檢出率為2.63%,其中肉樣82份,檢出3份,檢出率為3.66%;胴體拭子共121份，檢出4份，胴體拭子檢出率為3.31%(牛胴體拭子54份,檢出3份,檢出率為5.56%;羊胴體拭子67份,檢出1份,檢出率為1.49%);操作工具10份,檢出1份,檢出率為10.00%,雞肛拭子共152份,檢出2份,檢出率為1.31%。

3 結論與討論

3.1 庫爾勒市沙門菌的污染情況

本次對庫爾勒市市場及屠宰場內的牛羊肉及其胴體表面、加工用具,雞、羊肛拭子中的沙門菌污染情況調查研究顯示:加工用具、牛羊肉及其胴體表面、雞肛拭子中均存在沙門菌污染的情況,使用兩種方法共檢測380份受檢樣品,共同篩出沙門菌陽性樣品數為10份,沙門菌的陽性檢出率為2.63%,可見庫爾勒市屠宰場中肉樣和胴體拭子表面均存在沙門菌的污染。

本次對庫爾勒市場和屠宰場中的肉的污染率為3.66%,其胴體拭子3.31%。有研究表明,肉類及肉制品最易受到沙門菌的污染,Niyonzima等[11]檢測了肉類及其制品,顯示肉中的沙門菌污染率達到了21.4%。由于沙門菌在環境中廣泛存在,養殖場及其周圍可通過被污染的土壤及水源傳播,抵抗力較低的畜禽最易受感染,而這些畜禽是市場中肉制品的主要來源,若沒有及時控制污染源,極易造成污染擴散,污染的刀具等加工用具造成健康畜禽肉的二次污染[12]。這提示有關部門應加強對肉制品的監管,防止肉制品中沙門菌引起的食物中毒的爆發。

3.2 SE-μPADs快速檢測方法與國家標準方法結果對比

目前關于紙基微流控制芯片技術檢測沙門菌的相關報道較少,Jokerst等[13]利用酶底物法檢測沙門菌,從增菌到檢出時間僅需8～12 h,在富集期僅3 h后檢測到鼠傷寒沙門菌,檢測到的酯酶量為0.52±0.06 μg/mL。Bisha等[14]用μPAD檢測農業用水中的沙門菌,從制作裝置到顯色需要24 h。從兩種方法對沙門菌的檢測時間分析,國家標準方法檢測沙門菌從初增菌到接種至選擇性培養基上出現典型菌落需要約3 d,而SE-μPADs快速檢測試紙完成初篩需要21.5 h,與國家標準方法比較,在初篩的過程中縮短了約2 d,縮短了沙門菌的檢出時間。本實驗中在兩種方法的初篩過程中SE-μPADs快速檢測方法從粗增菌到顯色篩出疑似沙門菌的初篩率為6.6%,低于國家標準方法的初篩率20%(從初增菌到選擇性培養基出現典型菌落),進一步對該方法進行驗證,PCR方法進行鑒定后SE-μPADs快速檢測方法與國家標準方法的陽性符合率(靈敏度)為100%,說明SE-μPADs快速檢測方法能夠完成樣品的初篩工作,但在檢測過程中SE-μPADs快速檢測方法的陰性符合率(特異性)為94.92%,說明SE-μPADs快速檢測試紙還存在假陽性的問題,這提示SE-μPADs快速檢測試紙還有待進一步優化,減少假陽性,提高檢測的特異性。SE-μPADs快速檢測法具有快速簡單直觀經濟等優點,且試紙的成本更低,而且無需任何特殊熒光儀器設備,僅需肉眼可觀測到顏色,結果更加直觀。該檢測裝置利用比色的方法檢測食品中的沙門菌,相對于標準的培養技術,富集時間顯著減少,因此SE-μPADs快速檢測法是一種簡便、快捷的沙門菌檢測方法。SE-μPADs檢測裝置未來發展的目標是通過嘗試使用特異性誘導劑來增強酶的產生,以及利用選擇性富集培養基抑制競爭性微生物的生長來提高檢測限,縮短檢測時間,減少假陽性率的發生。

4 結論

SE-μPADs快速檢測方法能夠完成樣品的初篩,陽性符合率可以達到100%;庫爾勒市屠宰場及市場均存在沙門菌的污染且肉樣中沙門菌污染率較高,相關部門應加強屠宰場及市場中沙門菌的檢測及監管。