大鼠左全肺切除促進(jìn)肺血管重塑

許果，趙興吉，向小勇，王繼相，佘凱

(1.四川綿陽四0四醫(yī)院胸心外科，四川 綿陽 621000;2.重慶市急救醫(yī)療中心胸心外科，重慶 400014;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科，重慶 400016)

肺切除是臨床上治療肺部疾病的一種重要手段，隨著肺癌和肺結(jié)核發(fā)病率的增加，以及治療手段的進(jìn)步，全肺切除的比例有所增加［1，2］。現(xiàn)有關(guān)全肺切除的研究主要是圍手術(shù)期處理，對術(shù)后遠(yuǎn)期療效的評價(jià)缺乏病理學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過切除大鼠左全肺建立動(dòng)物模型，以模擬臨床全肺切除術(shù)后的病理生理改變，了解遠(yuǎn)期是否發(fā)生肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)，探討肺血管重塑可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級雄性 SD大鼠24只，2～3月齡，體重(248±26)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(渝)2007－0001］。實(shí)驗(yàn)場地由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SYXK(渝)2007－0001］。隨機(jī)分為2組:實(shí)驗(yàn)組12只，行左全肺切除;對照組12只，行假手術(shù)。術(shù)后飼養(yǎng)l2周。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立

3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，行氣管切開，置入自制氣管導(dǎo)管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)。沿左胸第五肋間進(jìn)入胸腔，切除左全肺。對照組麻醉同前，切口至壁層胸膜后，保持其完整，不入胸腔，縫合切口。

1.2.2 肺動(dòng)脈壓力測定

采用右心導(dǎo)管法測定平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)。

1.2.3 動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)測定

從左心室抽血，用于測定PaO2。

1.2.4 電鏡標(biāo)本制備及觀察

切除右肺，從外周部位及肺門水平切取2～3塊1～2 mm組織塊，處理后在電鏡下觀察肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的大小、形態(tài)、排列形式、細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化、表型的轉(zhuǎn)化等。

1.2.5 光鏡標(biāo)本制備及觀察

肺組織標(biāo)本用4%中性甲醛固定，用石蠟包埋，沿右肺門橫斷取材，分別作HE及免疫組化染色。

(1)三型肺小血管不同肌化程度百分比的測定:在400倍光鏡下，觀察并計(jì)數(shù)肺小血管(15 μm＜直徑≤200 μm)中肌型動(dòng)脈(muscularized artery，MA)、部分肌型動(dòng)脈(partially muscularized artery，PMA)及非肌型動(dòng)脈(non－muscularized artery，NMA)的數(shù)目，分別計(jì)算它們各占肺小血管總數(shù)的百分比，反映肺小血管的肌化程度。每例標(biāo)本觀測10個(gè)血管。

(2)肺中、小型動(dòng)脈相對中膜厚度及面積的測定:應(yīng)用Mias圖像分析系統(tǒng)測取動(dòng)脈外徑、中膜厚度(media thickness of vessel，MTV)、血管總面積及中膜面積(media area of vessel，MAV)，分別計(jì)算中膜厚度與動(dòng)脈外徑的比值(MTV%)，中膜面積與血管總面積的比值(MAV%)，作為肺血管重塑的指標(biāo)。每只大鼠各測量10個(gè)肺中型動(dòng)脈(100 μm ＜直徑≤200 μm)和肺小型動(dòng)脈(15 μm ＜直徑≤100 μm)上述各值，并求其均值。

1.2.6 肺組織免疫組織化學(xué)染色SABC法

操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.7 圖像分析

對免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度進(jìn)行測量，每張切片均測量其背景灰度，以消除切片間的誤差。用Image－Pro Plus圖像分析系統(tǒng)心肺血管分析軟件測取所選血管管壁陽性染色積分光密度(integrated optical density，IOD)作為肺動(dòng)脈管壁 VEGF和 HIF－1α的相對含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，統(tǒng)計(jì)方法采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行直線相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平均肺動(dòng)脈壓與動(dòng)脈血氧分壓的比較

實(shí)驗(yàn)組mPAP(31.91±1.98 mmHg)明顯高于對照組(17.82±1.94 mmHg)，PaO2(77.46±5.36 mmHg)明顯低于對照組(90.39±6.02 mmHg)，(P＜0.01)。

2.2 三型肺小血管不同肌化程度百分比的比較

實(shí)驗(yàn)組肺小血管中MA%和PMA%(22.50±4.52，23.33±4.92)明顯高于對照組(13.33±4.92，14.17±5.15)(P＜0.01)，NMA%(54.17±5.15)明顯低于對照組(72.50±7.54)(P＜0.01)。

2.3 肺小血管結(jié)構(gòu)改變

HE染色顯示對照組的肺小血管管壁較薄，內(nèi)膜光滑，管腔較大，平滑肌細(xì)胞走行一致(圖1)。而實(shí)驗(yàn)組肺小血管收縮，管壁增厚，管腔狹窄、肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖(圖2)。圖像分析表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺中、小型動(dòng)脈 MTV、MAV、MTV%和MAV%明顯高于對照組(P＜0.01)(表1、2)。

2.4 肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化

電鏡觀察到對照組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞體扁平，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常。實(shí)驗(yàn)組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞體積增大，基底變窄，呈柱狀突入管腔，細(xì)胞器豐富，甚至見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)大量空泡形成。對照組中膜平滑肌細(xì)胞胞體小，平滑肌細(xì)胞呈收縮表型。實(shí)驗(yàn)組中膜平滑肌細(xì)胞數(shù)量增多，胞體肥大，細(xì)胞器增多，不同程度向合成表型轉(zhuǎn)化。平滑肌細(xì)胞間及肺間質(zhì)見膠原纖維密集，細(xì)胞外基質(zhì)增多(圖3～5)。

2.5 肺小血管壁VEGF與HIF-1α的表達(dá)

經(jīng)灰度掃描，實(shí)驗(yàn)組肺動(dòng)脈壁VEGF及HIF－1α的IOD值(42.04±3.79，26.47±4.16)明顯高于對照組(11.53±2.29，6.12±2.14)(P ＜0.01)。相關(guān)分析表明，VEGF及 HIF－1α陽性染色強(qiáng)度與 PaO2呈負(fù)相關(guān)(r= －0.734，r= －0.712)(P ＜0.01)，與肺小動(dòng)脈MTV%(r=0.672，r=0.657)(P＜0.05)及MAV%(r=0.718，r=0.684)(P ＜ 0.01，P ＜0.05)呈正相關(guān)，HIF－1α與VEGF的陽性染色強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.627)(P＜0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺中動(dòng)脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺中動(dòng)脈外徑、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.1 Changes of the external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，and MAV%of the median pulmonary arteries in rats of the two groups

注:*P＜0.01，同對照組比較。Note.*P＜0.01，compared with the control group.

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表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺小動(dòng)脈外經(jīng)、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups

表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠肺小動(dòng)脈外經(jīng)、中膜厚度、MTV%、血管總面積、中膜面積及MAV%的比較()Tab.2 Changes of external diameter，media thickness of vessel，MTV% ，total vascular area，media area of vessel，MAV%of small pulmonary arteries in rats of the two groups

注:*P＜0.01，同對照組比較。Note.*P＜0.01，compared with the control group.

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3 討論

3.1 PH動(dòng)物模型的建立及評價(jià)

導(dǎo)致PH的病因復(fù)雜多樣，既往許多學(xué)者用多種動(dòng)物和不同的方法建立過PH動(dòng)物模型，以模擬不同的發(fā)病因素。如利用大動(dòng)物建立體－肺分流［3－5］，經(jīng)頸部動(dòng)靜脈血管吻合，用探針穿破主動(dòng)脈－下腔靜脈［6］，給大鼠注射野百合堿(monocrotaline，MCT)，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮損傷，從而形成 PH［7］，以及降低氧濃度來誘發(fā)PH［8］等。這些模型都存在不同的局限性，并且不能模擬外科全肺切除后病人的病理生理改變。

圖1 對照組大鼠肺小動(dòng)脈(HE染色×100)Fig.1 A small pulmonary artery of a control rat.HE staining，×100

圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠肺小動(dòng)脈(HE染色×100)Fig.2 A small pulmonary artery of an experimental rat.HE staining，×100

圖3 對照組:肺血管內(nèi)皮細(xì)胞胞體扁平，結(jié)構(gòu)正常(×8000)Fig.3 Control group:endothelial cells of the pulmonary artery are flat，the structures are normal. ×8000

圖4 實(shí)驗(yàn)組:肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈高柱狀，突入管腔(×8000)Fig.4 Experimental group:endothelial cells of an intra－alveolar pulmonary artery are cubic. ×8000

圖5 實(shí)驗(yàn)組:間質(zhì)膠原纖維堆積(×5000)Fig.5 Experimental group:increase of interstitial collagen fibers.×5000

我們采取左全肺切除方法建立的動(dòng)物模型，術(shù)后12周測得mPAP明顯升高，表明PH動(dòng)物模型建立成功。光鏡和電鏡檢查下的病理改變導(dǎo)致肺血管橫截面積顯著增加，肺循環(huán)阻力持續(xù)升高，與文獻(xiàn)報(bào)道的肺動(dòng)脈高壓組織學(xué)改變是一致的，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈發(fā)生了肺血管重塑，導(dǎo)致PH行成。

在該模型中，除行肺切除外，未施加其他干預(yù)措施，觀察時(shí)間較長，能較準(zhǔn)確地模擬臨床全肺切除術(shù)后的病理生理改變。由于大鼠體積小、價(jià)格低廉，該方法手術(shù)操作簡單，不需吻合血管，單人肉眼即可完成，也不需要顯微鏡等特殊器械，避免了許多精細(xì)復(fù)雜的操作和吻合口出血、梗阻、狹窄等主要并發(fā)癥，手術(shù)過程相對簡單，動(dòng)物存活率高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。因此，本模型在PH的研究中有應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研究肺血管重塑和PH的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而探索干預(yù)途徑提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

3.2 HIF-1α與VEGF在肺血管重建中的作用

HIF－l是一種轉(zhuǎn)錄因子，由α和β兩個(gè)蛋白亞基組成，HIF－1α多肽鏈?zhǔn)俏┮坏难跽{(diào)節(jié)亞單位，它決定HIF－1的活性。HIF－1α是細(xì)胞最早感受缺氧刺激的因子之一。常氧條件下HIF－1無DNA結(jié)合活性，而在低氧條件下其表達(dá)顯著升高［9，10］。本研究中檢測到實(shí)驗(yàn)組大鼠存在慢性低氧血癥，在其肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和支氣管內(nèi)皮細(xì)胞等處有明顯的HIF－1α免疫陽性表達(dá)。說明由于大鼠左肺切除導(dǎo)致的低氧血癥刺激誘導(dǎo)了肺內(nèi)HIF－1α表達(dá)增加。HIF－1α可誘導(dǎo)大量與低氧應(yīng)答有關(guān)的下游目的基因的表達(dá)，如 VEGF、EPO、iNOS 等［11，12］。在這些細(xì)胞因子作用下，血管平滑肌細(xì)胞(PASMC)大量增殖，使血管中膜增厚和非肌性血管肌化，血管腔變窄，同時(shí)PASMC合成分泌的細(xì)胞外基質(zhì)增多，使肺血管彈性回縮力和順應(yīng)性降低，血流阻力增加，促進(jìn)PH形成［13，14］。這與本研究中觀察到的病理改變是一致的。

VEGF是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，肺是體內(nèi)VEGF最大的來源。VEGF的主要生物學(xué)功能是與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而促進(jìn)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的生長，合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)［15］。近年還發(fā)現(xiàn)其增強(qiáng)血管尤其是微小血管的滲透性，使纖維蛋白原等大分子血漿蛋白外滲沉積在血管外的基質(zhì)中。

VEGF基因表達(dá)受多種細(xì)胞因子調(diào)控，其中低氧導(dǎo)致的VEGF表達(dá)主要是通過HIF－1實(shí)現(xiàn)的［16］。在低氧情況下，HIF－1增加了VEGF的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和VEGF mRNA的穩(wěn)定性。低氧刺激還引起血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上與VEGF結(jié)合的受體表達(dá)明顯增多，從而增加VEGF的生物效應(yīng)［17］。在本研究中可見到低氧條件下EVGF在實(shí)驗(yàn)組大鼠肺動(dòng)脈壁、肺間質(zhì)等處明顯的免疫陽性表達(dá)。而重要的是，HIF－1α與VEGF的陽性表達(dá)呈正相關(guān)。

結(jié)合本研究我們發(fā)現(xiàn)，低氧血癥是大鼠左全肺切除后肺血管重建的重要因素。當(dāng)?shù)脱醮碳ねㄟ^血流到達(dá)血管壁時(shí)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分泌功能和細(xì)胞骨架的改變，誘導(dǎo)合成和分泌HIF－1α 及VEGF 增加，通過 HIF－1α－VEGF 途徑參與了低氧性肺血管重建過程。

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