HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表達載體的構建及鑒定

方芳，胡爾西旦·尼牙孜，武貴臻，阿布力孜·阿布杜拉，盛磊(新疆醫科大學第一附屬醫院婦科，第一附屬醫院腫瘤中心，烏魯木齊80054;新疆地方病分子生物學重點實驗室，烏魯木齊800)

HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表達載體的構建及鑒定

方芳1，胡爾西旦·尼牙孜2，武貴臻3，阿布力孜·阿布杜拉3，盛磊3
(新疆醫科大學1第一附屬醫院婦科，2第一附屬醫院腫瘤中心，烏魯木齊830054;3新疆地方病分子生物學重點實驗室，烏魯木齊830011)

目的構建人乳頭瘤病毒(HPV)E6、E7基因慢病毒真核表達載體。方法以SiHa宮頸癌細胞總RNA為模板，利用RT-PCR技術擴增出E6、E7目的片段;選用病毒載體pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit系統構建E6、E7基因慢病毒真核表達載體;分別使用構建好的E6、E7載體轉染病毒包裝細胞，獲得含病毒的上清液，并測定上清液中慢病毒的滴度。結果質粒測序所得序列與人乳頭瘤病毒E6、E7基因序列完全吻合，載體構建成功;慢病毒滴度測定結果顯示E6樣品的慢病毒滴度為1.5×108TU/mL，E7樣品的慢病毒滴度為2×108TU/mL，該滴度能夠滿足后續研究所需。結論HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表達載體構建成功，可以為進一步研究人乳頭瘤病毒E6、E7基因致病機理奠定物質基礎。

宮頸癌;HPV16;E6、E7基因;慢病毒載體

人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus HPV)是一種環狀雙鏈DNA病毒，長約8 kb，由72個病毒殼粒包被，穩定性好，廣泛分布于自然界中。該病毒具有嗜上皮性，通過微創口侵入皮膚黏膜表層，進而感染基底層細胞。病毒的增殖依賴于上皮細胞的分化，并在鱗狀上皮細胞中被復制、轉錄和翻譯。HPV病毒種類達100多種，根據其致病程度與癌癥轉化能力分為高危型、中危型和低危型等3種類型。HPV-16、HPV-18、HPV-45和HPV-56等屬于高危型，在宮頸癌標本中的檢出率達80%［1-4］。研究發現高危型HPV編碼的E6或E7蛋白可以影響宿主細胞DNA損傷修復、細胞凋亡和細胞周期控制機制，促進細胞增長與繁殖［5-7］;單純E6、E7基因的表達，對腫瘤細胞生長與繁殖的影響不同［8］。因此，本研究通過應用分子克隆技術構建HPV-16 E6、E7基因的慢病毒真核表達載體，為進一步研究HPV-16 E6、E7基因致癌機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit(Invitrogen)，QuickTiterTMLentivirus Titer Kit(Cell BioLabs)，青霉素/鏈霉素(Sigma)，Geneticin(Sigma)，DMEM培養基(Gibico)，FBS (Gibico)，反轉錄試劑盒及Pfu酶PCR試劑盒(Fermentas)，高效制備感受態細胞試劑盒(生工生物工程公司)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及高純度質粒提取試劑盒(天根生化公司)。實驗中使用的SiHa細胞株來自于中國科學院上海生物化學研究所細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得使用TRIzol法提取HPV-16陽性SiHa宮頸癌細胞株的總RNA，以其為模板反轉錄合成cDNA。根據pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit試劑盒引物設計要求設計并合成引物(引物序列見表1)，以cDNA為模板，使用Pfu酶PCR試劑盒合成目的基因E6、E7片段，并用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 目的基因的引物序列

1.2.2 目的基因的純化使用瓊脂糖凝膠回收純化法對目的DNA進行純化(具體操作參照大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說明書)，并利用快速核酸/蛋白分析儀對回收所得DNA濃度進行測定。

1.2.3 感受態大腸桿菌制備使用CaCl2法制備感受態細胞(具體操作參照高效制備感受態細胞試劑盒使用說明書)，分裝投入液氮速凍后，-70℃保存。

1.2.4 重組DNA的導入將純化后的PCR產物4μL、Salt Solution 1μL、TOPO vector(藍色示正常) 1μL混合為TOPO Mix，22℃孵育30 min。將重組質粒導入Stbl3感受態細胞，并使用ampicillin進行抗生素篩選(100μg/mL)，從而獲得陽性克隆。

1.2.5 E6、E7基因慢病毒載體的獲取及鑒定挑取陽性克隆進行擴增，使用高純度質粒提取試劑盒提取重組質粒，利用快速核酸/蛋白分析儀測量所提取質粒DNA的濃度及純度。以質粒DNA為模板，PCR擴增E6、E7基因。最后送測序進行鑒定。

1.2.6 慢病毒的包裝和獲取使用含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素和500μg/mL Geneticin的DMEM(高糖)完全培養基常規培養293FT細胞。分別使用構建好的pLenti6/V5-E6和pLenti6/V5-E7聯合病毒包裝質粒共同轉染293FT細胞。轉染48 h后收集含病毒的上清液，4℃、3 000 r/min離心15 min，并使用0.22μm濾膜進行濾過除菌，最終將無菌的含病毒上清-80℃凍存。

1.2.7 慢病毒滴度測定使用QuickTiterTMLentivirus Titer Kit試劑盒，利用ELISA原理檢測慢病毒p24核心蛋白(具體操作步驟參照試劑盒說明書)。根據倍比稀釋p24蛋白標準品的濃度及其在450 nm處的OD值繪制標準曲線，分別計算出待測樣品E6及E7中p24蛋白濃度，由于每個慢病毒顆粒(Lentiviral particle，LP)約含2 000分子p24蛋白，1ng p24蛋白相當于1.25×107LPs，1 TU LP約為1 000個LPs，因此80 ng/m L p24蛋白相當于106TU/ mL慢病毒。具體計算公式:病毒滴度=p24蛋白濃度÷80 ng/mL×106TU/m L×稀釋倍數。

2 結果

2.1 目的基因的獲得及純化用特異性引物對E6、E7基因進行PCR擴增，將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在476 bp處和296 bp處分別可見2條明亮的條帶，即通過PCR已獲得了目的基因(圖1)。將E6、E7基因PCR產物經過瓊脂糖凝膠純化回收后，使用快速核酸/蛋白分析儀測量的結果分別為:E6基因0.023μg/μL，260/280為1.798;E7基因0.023μg/μL，260/280為1.801。

圖1 E6、E7基因PCR產物

2.3 目的基因的連接及重組DNA的導入將含有重組DNA的大腸桿菌接種在固體培養基上過夜培養后，可見數目不等的白色菌落，選取菌落密度合適的培養平板挑取單克隆進行擴增。

2.4 pLenti6/V5-E6載體的鑒定使用快速核酸/蛋白分析儀測得的pLenti6/V5-E6質粒DNA濃度為0.746μg/μL，260/280 1.802。以質粒DNA為模板PCR擴增E6基因，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶較清晰。對質粒DNA進行測序發現所連接的片段序列分別與E6基因序列完全一致(圖2)。

2.5 pLenti6/V5-E7載體的鑒定使用快速核酸/蛋白分析儀測得的pLenti6/V5-E7質粒DNA濃度為0.757μL，260/280 1.778。以質粒DNA為模板PCR擴增E7基因，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶較清晰。對質粒DNA進行測序發現所連接的片段序列分別與E7基因序列完全一致(圖3)。

2.6 慢病毒滴度測定測得樣品E6中p24蛋白濃度為61 ng/ml，E7中p24蛋白濃度為83 ng/mL。根據公式計算，E6樣品的慢病毒滴度為1.5×108TU/ mL;E7樣品的慢病毒滴度為2×108TU/m L，該滴度能夠滿足后續研究所需。

圖2 pLenti6/V5-E6質粒的鑒定

3 討論

宮頸癌是女性最常見的生殖系統惡性腫瘤，嚴重威脅著婦女的健康，其發病率僅次于乳腺癌［9］，在全球女性惡性腫瘤中位居第2位。我國宮頸癌發病率高，每年有近15萬新發病例［10］。新疆維吾爾族婦女宮頸癌屬新疆特高發腫瘤，其發病率及死亡率均居全國第1位［11］。人乳頭瘤病毒(HPV)被公認為宮頸癌發生的首要因素，其中又以高危型HPV-16感染與宮頸鱗癌關系最為密切。以往的研究顯示，HPV與TK1、SPP1、HLA-I、Smad4、Runx3、CALCA等宮頸癌相關的生物標記物的表達變化有著密切的關系［12-16］。隨著近些年來人們對HPV不斷地研究，已初步揭示了HPV致癌的分子機制，其中E6、E7蛋白被認為是HPV致癌的關鍵分子［18］。HPV基整合入宿主細胞基因組后，病毒E6、E7基因與細胞基因之間的復雜聯系有待于進一步的研究。因此，成功構建HPV-16 E6、E7基因的真核表達載體，使之成為細胞水平研究HPV-16 E6、E7基因致癌機制的工具，對全面而深入地揭示HPV-16 E6、E7基因在宮頸癌發生、發展中的作用具有極其重要意義。

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)為來源的一種病毒載體，它包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因的轉導效率，且目的基因整合到宿主細胞基因組的概率大大增加，能夠比較方便快捷地實現目的基因的長期、穩定表達。

圖3 pLenti6/V5-E7質粒的鑒定

在載體構建過程當中，目的基因與質粒載體的連接是一個非常關鍵的步驟，其直接影響著載體的轉化效率。本實驗采用特殊的聚合酶鏈反應特異引物連接法，而不使用酶切，設計引物時在上游引物的5’末端添加序列CACC，這4個堿基可與克隆載體的突出末端GTGG配對結合(對立的末端不匹配)，從而使得由PCR獲得的目的基因片段可被定向地連接到該載體上，連接率可達到90%以上。

本研究針對HPV-16 E6、E7致癌基因，以HPV-16陽性SiHa宮頸癌細胞株總RNA為模板，利用RT-PCR技術擴增出E6、E7目的基因，選擇pLenti6/V5慢病毒載體并利用定向TOPO克隆技術將目的基因正確地連接在該載體上，然后將重組DNA導入感受態細胞293FT，通過抗生素篩選出陽性克隆，繼續培養，從而獲得大量陽性克隆。最終通過測序的方法對所構建的HPV-16 E6、E7基因表達載體進行鑒定。測序結果顯示，與Genebank中HPV-16 E6、E7基因原序列相比，載體中的插入序列與之完全相同，說明載體構建成功。使用慢病毒p24核心蛋測定法測定慢病毒滴度，結果顯示E6、E7病毒上清液中慢病毒的滴度均能滿足后續研究所需。

綜上所述，以HPV-16 E6、E7基因為對象，利用分子克隆技術成功構建了HPV-16 E6、E7基因的慢病毒真核表達載體，轉染病毒包裝細胞后獲取含病毒的上清，為進一步研究HPV-16 E6、E7蛋白作用及致癌機制奠定物質基礎，對促進新疆維吾爾族婦女宮頸癌疾病的研究有著積極的作用。

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Construction and identification of eukaryotic vector of HPV-16 E6，E7 genes

FANG Fang1，Huerxidan Niyazi2，WU Guizhen3，Abulizi Abudula3，SHENG Lei3
(1Department of Gynaecology，The First Afiliated Hospital，2Department of Tumor Center，The First Afiliated Hospital，Urumqi830054，China;3Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology and Endemic Diseases，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Objective To construct the eukaryotic expression vector for human papillomavirus(HPV)E6 and E7 genes.Methods We amplified the full-length HPV-16 E6 and E7 genes from the total RNA of the SiHa cell line by RT-PCR technique and sub-cloned the gene into pLenti6/V5 vector，which was identified and confirmed by DNA sequencing.The construction of E6 and E7 transfected viruses was used to package cells.Then we harvested viral supematantand determined the titer.Resu lts The plasmid sequencingwas completely consistentwith E6，E7 gene sequence，which showed that the vector was successfully constructed.The titer of E6 was 1.5×108TU/m L，and 2×108TU/m L of E7，satisfying the requirements of the subsequent researches.Conclusion The successful construction of HPV-16 E6 and E7 gene eukaryotic expression vector could lay thematerial foundation for furthering study of the pathogenesis of HPV E6 and E7 genes.

ervical cancer;HPV-16;E6，E7 genes;Lentivirus vector

R737.33

A

1009-5551(2015)06-0734-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.018

2014-11-03］

(本文編輯楊晨晨)

新疆維吾爾自治區重點實驗室開放課題基金(XJDX0208-2012-03);新疆醫科大學科研創新基金(XJC201310)

方芳(1982-)，女，在讀碩士，研究方向:婦科腫瘤。

盛磊，女，實驗師，研究方向:宮頸癌的發病機制與早期預警，E-mail:shenglei950505@163.com。