應用熒光原位雜交技術檢測多發性骨髓瘤染色體異常的研究

劉穎，王蕾，王新有，孫明玲，郭新紅(新疆醫科大學第一附屬醫院血液病中心，烏魯木齊830054)

應用熒光原位雜交技術檢測多發性骨髓瘤染色體異常的研究

劉穎，王蕾，王新有，孫明玲，郭新紅
(新疆醫科大學第一附屬醫院血液病中心，烏魯木齊830054)

目的探討應用熒光原位雜交(FISH)技術檢測多發性骨髓瘤(MM)的常見基因異常。方法收集新疆醫科大學第一附屬醫院2010年1月-2013年12月初治的16例MM患者的骨髓標本，應用FISH技術對1q2l擴增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失及IGH重排5種染色體異常進行檢測，并與常規的細胞遺傳學方法(CC)進行比較。結果16例MM患者中應用FISH技術檢測出染色體異常為9例(56.25%)，CC的染色體異常檢出率僅為20%(2/10)。FISH技術中IGH重排陽性率為43.75%(7/16)，RB1缺失5例(31.25%)，lq21擴增2例(12.5%)，D13S319缺失2例(12.5%)，p53缺失1例(6.25%)。β2-MG與IGH重排、p53缺失呈正相關(P＜0.05)，骨髓漿細胞增多與IGH易位及D13S319缺失呈正相關(P＜0.05)。染色體異常與患者的性別、年齡、M蛋白類型、分期、血細胞計數、血鈣、C-反應蛋白(CRP)均無明顯相關性(P＞0.05)。結論MM最常見的基因異常是IGH重排及13q缺失;p53缺失的發生率較低。FISH技術對于MM染色體異常的檢出率高于常規細胞遺傳學方法。

熒光免疫雜交技術;多發性骨髓瘤;常規細胞遺傳學方法

多發性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一種較常見的好發于中老年的漿細胞單克隆惡性增殖的血液系統腫瘤。最近的研究顯示，MM發生基因與染色體異常的概率很高且常常具有獨立的預后判斷價值［1］。但是常規細胞遺傳學方法(conventional cytogenetics，CC)對異常染色體的檢出率比較低，隨著熒光原位雜交(Fluorescent in situ hybridization，FISH)技術的不斷進展，明顯提高了MM的染色體異常的檢出率，推進了MM的細胞遺傳學研究，同時還具有操作簡便、重復性好及特異性高等優點。本研究同時采用CC及FISH技術檢測16例初治多發性骨髓瘤患者的染色體，對2種檢測方法進行比較，旨在為臨床評估預后提供依據，也為實現個體化治療奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2010年1月-2013年12月在新疆醫科大學第一附屬醫院就診的初治MM患者16例，其中男性11例，女性5例，年齡39～78歲，中位年齡59歲。所有病例均經骨髓形態學、免疫分型和免疫固定電泳確診，診斷標準符合《血液病診斷及療效標準》［2］。根據Durie-Salmon分期和國際分期系統(international staging system，ISS)進行分期［3］。按Durie-Salmon分期:Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期12例。免疫球蛋白類型:IgG型9例(56.25%)，IgA型2例(12.5%)，κ輕鏈型1例(6.25%)，λ輕鏈型2例(12.5%)，不分泌型2例(12.5%)。

1.2 常規染色體分析采集肝素抗凝的骨髓標本，用不加有絲分裂原刺激劑的24 h培養法制備染色體標本，G-顯帶進行染色體核型分析，每例至少分析20個中期分裂相。根據《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN1995)》識別及分析核型異常。

1.3 FISH檢測

1.3.1 標本制備及探針儀器的選擇用肝素鈉抗凝管采集患者骨髓標本，細胞經分離、洗滌、低滲、固定、滴片處理后室溫下過夜。位點特異性探針(1ocus speeifie prober，LSI)lq21、RB1、D13S319、p53、IGH均購自北京金菩嘉公司。lq21探針用于檢測1號染色體長臂的異常，RB1探針檢測13號染色體RB1位點缺失，p53探針檢測17號染色體短臂的缺失，D13S319探針檢測13q14.3缺失，IGH探針檢測14q32易位。按照探針試劑的說明書進行DNA變性、雜交、洗片及復染。用Olympus BX51熒光顯微鏡進行圖形采集，VideoTest Fish2.0系統進行圖像分析。

1.3.2 正常閾值的建立采集10例健康人的骨髓標本，采用lq21/RB1、D13S319/p53、IGH3組LSI進行FISH檢測。分析10例健康對照骨髓單核細胞標本的200個間期細胞，計算出y陽性信號細胞百分比的均值及標準差(s)，用(±3s)定義為正常閾值。

1.3.3 結果判斷標準D13S319探針在正常間期細胞中表現為2個紅色熒光信號，只有1個紅色信號為異常;RB1探針和p53探針在正常間期細胞中表現為2個綠色熒光信號，只有1個綠色熒光信號為異常;lq21探針在正常間期細胞中表現為2個紅色熒光信號，出現3個或3個以上紅色熒光信號為異常;IGH探針在正常間期細胞中出現2個紅色和綠色信號融合而成的黃色熒光信號，出現兩紅兩綠或一紅一綠一黃判斷為異常(圖1)。如果檢測值大于正常閾值，則判定為陽性。

1.4 統計學處理應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，兩組率的比較采用χ2檢驗，相關性分析用分類變量的關聯性分析及Spearman秩相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 探針信號異常

2 結果

2.1 正常閾值正常對照組1q21的閾值為5.1%，RB1的閾值為6.2%，D13S319的閾值為7.7%，p53的閾值為5.5%，IGH的閾值為3.7%。

2.2 常規細胞遺傳學結果16例MM患者中6例(37.5%)因細胞數少或無分裂象未成功進行核型分析，有分裂象的10例(62.5%)中2例(20%)檢測出存在染色體異常，其余8例均為正常核型。異常核型檢出率為20%。

2.3 FISH檢測結果16例MM患者中9例(56.25%)檢測出不同類型的基因異常。其中IGH基因重排7例(43.75%)，RB1缺失5例(31.25%)，lq21擴增2例(12.5%)，D13S319缺失2例(12.5%)，p53缺失1例(6.25%)。9例檢出染色體異常患者中，1種異常者3例(18.75%)，2種異常者4例(25%)，3種異常者2例(12.5%)，未檢出4種及5種染色體異常同時發生的情況。檢出2種及以上異常占所有患者的43.75%，占可檢出異常者的77.8%。CC異常染色體的檢出率為20%，應用FISH技術的檢出率為56.25%，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 FISH檢測結果與臨床相關因素分析5種染色體異常與患者的性別、年齡、M蛋白類型、分期、血細胞計數、血鈣、CRP均無相關性(P＞0.05)。β2-MG與IGH重排、p53缺失呈正相關(P＜0.05)，與lq21、RB1、D13S319基因異常無相關性(P＞0.05)。骨髓漿細胞增多與IGH易位及D13S319缺失呈正相關(P＜0.05)，與lq21、RB1、p53、IGH異常無相關性(P＞0.05)。伴有1q21擴增及p53基因缺失的MM患者死亡率明顯高于陰性組(P＜0.05)，伴有IGH易位及del(13ql4)MM患者死亡率與陰性組患者比較差異無統計學意義(表1)。

表1 染色體異常與臨床因素相關性

3 討論

MM患者幾乎均存在分子遺傳學異常，MM染色體核型多變而且非常復雜，一般表現為染色體數目和結構的異常。CC對染色體異常的檢出率較低，這與骨髓瘤細胞比例低、體外有絲分裂指數低、中期分裂相少且多為正常分裂相等因素有關。然而FISH技術可以通過預先設定特異的基因探針來識別染色體異常，并且可以使用未培養的間期細胞，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，同時也很大程度地縮短了檢測時間。但是FISH技術也存在無法檢測出未知染色體的缺陷。本研究同時應用CC和FISH技術檢測16例MM患者的染色體核型，其異常染色體的檢出率分別為20%和56.25%，二者差異有統計學意義(P＜0.05)。提示，當同時運用2種檢測手段檢測同一種染色體異常時，FISH技術體現出了其具有更高的檢出率，和更為敏感、可靠的優越性。

IGH基因(14q32)易位是MM發病的第一步，同時也是MM最常見的基因異常，而13q缺失和1q2l擴增較IGH易位少見［4-5］。本研究FISH檢測結果顯示:16例MM患者14q32重排為43.75%(7/ 16)，del(13q14)的陽性率也為43.75%(7/16)，其次1q21為12.5%(2/16)，最少見為p53缺失，陽性率為6.25%(1/16)。本研究顯示，在MM的染色體異常中，IGH易位和13q缺失最常見，而1q2l擴增及p53缺失較少見，這與Steward等［6］報道的結果基本一致。

MM患者存在l號染色體異常往往提示疾病預后差、生存期短［7］。Chang等［8］對203例初治MM患者進行研究，發現有36例患者存在lp21缺失，lp21和lq21密切相關，是預后不良的因素。但是大量實驗證實存在t(11;14)的患者預后較好，伴有t (4;14)的患者預后較差。因此認為lq21并不是MM的獨立預后因素，其對預后的影響主要是由于lq21與t(4;14)等其他不良預后因素相關而造成的［9］。本研究結果顯示lq21發生率為12.5%，低于國際報道，還發現1q21擴增與MM患者死亡率相關，但由于病例數較少，關于1q21擴增是否是MM的獨立預后因素還有待于進一步擴大病例數證實。有研究指出p53缺失在MM中發生率很低，一旦出現則提示疾病晚期預后不良［10］。p53基因位于17號染色體的短臂，是與細胞周期相關的抑癌基因。研究顯示p53基因缺失可能是導致腫瘤的發生的原因，但其在血液系統腫瘤中突變率較低。在本研究中p53缺失最少見，陽性率僅為6.25%(1/16)，低于Schop等［11］和Chang等［12］報道，考慮可能與本組病例數較少相關，可進一步擴大試驗樣本量來驗證。本研究還顯示同時檢出2個及2個以上基因異常占所有異常的77.8%，說明大多數MM病例可同時涉及多個基因異常。

骨髓瘤細胞可以分泌β2-MG并釋放入血，因此高水平的β2-MG往往提示腫瘤負荷高，也是提示預后不良的因素。本研究顯示，β2-MG與IGH重排、p53缺失呈正相關，差異有統計學意義，由此說明IGH重排及P53缺失可能是MM的不良預后因素。

總之，應用FISH技術可顯著提高MM患者細胞分子遺傳學異常的檢出率，對于初治MM患者需常規進行FISH檢測，可了解其基因異常，對預后進行評估，為指導臨床選擇個體化治療方案提供依據。所以應將FISH作為常規檢查在臨床上廣泛推廣應用。但MM的染色體異常多為復雜核型異常，故FISH檢測技術有其一定局限性，并不能取代常規的檢測手段，進行研究時可考慮聯合多種方法進行檢測。

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Fluorescence in situ hybridization technology in the study ofmultip lem yelom a

LIU Ying，WANG Lei，WANG Xinyou，SUN Mingling，GUO Xinhong
(Department of Hematology Centre，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi830054，China)

Objective To explore the common genetic abnormalities in the patientswithmultiplemyeloma(MM) by fluorescence in situ hybridization(FISH).Methods 16 caseswith MMtreated in the First Affiliated Hospital to Xinjiang Medical University in 2010.1-2013.12 were collected.Interphase fluorescence in situ hybridization was adopted to detect lq21 amplification，RBl deletion，Dl3S319 deletion，p53 deletion and IGH rearrangement.The difference in chromosomal abnormalitieswas compared by FISH and other conventional cytogenetics.Resu lts Nine of the 16 patientswere detected chromosomal abnormalities by FISH and the detection rate of the conventional chromosome examination was 20%only.The positive rates of 14q32，del(13q14)，1q21，and p53 by FISH were 43.75%(7 in 16)，43.75%(7 in 16)，12.5%(2 in 16)and 6.25%(1 in 16).Compared with clinical factors，genetic abnormalities showed thatβ2-MG in IGH abnormal and p53 deletion patients were significantly higher than others(P＜0.05).Patients with increasing bone marrow cells of 14q32 and p53 deletion were higher than those without such abnormalities(P＜0.05).No significant difference was observed in the relationship between chromosome aberration and sex，age，stage，blood corpuscle，blood calcium and CRP.Conclusion It proved that the most common genetic abnormalities in MMwas IGH rearrangement and del(13q14)，with lower occurrence rate of p53 deletion.MMdetection rate of chromosomal abnormalities by FISH was significantly superior to the traditional methods.

fluorescence in situ hybridization;multiplemyeloma;conventional cytogenetics

R446;R733

A

1009-5551(2015)06-0725-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.016

2014-06-22］

(本文編輯周芳)

新疆維吾爾自治區自然科學基金(2014211C043)

劉穎(1983-)，女，碩士，住院醫師，研究方向:血液系統惡性腫瘤。

郭新紅，女，主任醫師，碩士生導師，研究方向:血液系統惡性腫瘤，E-mail:guoxinhong222@sina.cn。