榅桲葉多糖含量測定和純化工藝研究

美合日阿依·伊薩克，艾尼瓦爾·吾買爾(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011)

榅桲葉多糖含量測定和純化工藝研究

美合日阿依·伊薩克，艾尼瓦爾·吾買爾
(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011)

目的測定榅桲葉中多糖的含量及其精制工藝研究。方法采用蒽酮-硫酸法測定榅桲葉中多糖的含量，比較6種大孔吸附樹脂對榅桲葉多糖的吸附率、解吸率和脫色率的影響，從中篩選出適合榅桲葉多糖分離純化的樹脂。結(jié)果經(jīng)靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)，初步確定HPD-100型大孔吸附樹脂為純化榅桲葉中多糖的適宜樹脂，其吸附、解吸和脫色效果最好，結(jié)果分別為56.2%、76.6%、63.0%，純化后榅桲葉中多糖含量為63.0%。結(jié)論優(yōu)選的純化工藝簡單可行、穩(wěn)定。

榅桲葉;多糖;含量測定;純化

榅桲英文名quince，拉丁文名:Cydonia oblonga Mill(COM)，異名:C.vulgaris Pers。科屬:薔薇科榅桲屬，別名:木梨，新疆維吾爾族人稱榅桲為“比也”，當(dāng)?shù)貪h族人稱此為木瓜。榅桲屬僅榅桲一種，是古老珍奇稀少的果樹之一［1］。榅桲自古以來，不僅是新疆人民喜歡的水果，也是維吾爾醫(yī)藥常用的療效很好的一種藥物，其除了具有降血壓、降血脂等作用外，還有補(bǔ)血、補(bǔ)腦、補(bǔ)腎、止咳、止瀉、利尿、開胃、月經(jīng)不調(diào)、心臟病等功效，特別是止咳、止瀉、調(diào)月經(jīng)作用甚佳［2-4］。

目前，有關(guān)榅桲葉中多糖的含量測定和純化工藝的研究尚未見報(bào)道，造成了資源的極大浪費(fèi)。本研究通過蒽酮-硫酸法測定關(guān)榅桲葉中多糖的含量，采用大孔樹脂純化，為榅桲葉資源的合理開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器和材料

島津UV-2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，賽多利斯BS型電子天平(德國Sartorius公司)，TDL-5A型離心機(jī)(上海非恰爾分析儀器有限公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

葡萄糖(天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心)，蒽酮(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，濃硫酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20121218)，試劑均為分析純，大孔樹脂AB-8(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，20130311)，S-8(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，HPD-100(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，HPD-400(滄州寶恩吸附材料科技有限公司);聚酰胺14-30(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠，20091017)，聚酰胺30-60(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠，20120312)。

2 方法與結(jié)果

2.1 榅桲葉中多糖的提取分離稱取榅桲葉，加一定量的95%乙醇超聲提取，抽慮，揮干至無醇味。加20倍的蒸餾水在80℃下、超聲提取60 min，提取2次，合并提取液濃縮，離心后用sevag法脫蛋白，加入95%乙醇使含醇量達(dá)80%醇沉，靜置過夜，沉淀用丙酮和乙醚依次洗滌，干燥即得榅桲葉粗多糖［5］。

2.2 榅桲葉中多糖的含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL葡萄糖對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制精密稱取提取的粗多糖10 mg，置25 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度。

2.2.3 蒽酮-硫酸試劑的配制精密稱取蒽酮50mg，置50 mL棕色容量瓶中，用95%～98%濃硫酸溶解并定容至刻度，搖勻，即得。臨用現(xiàn)配。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［6-9］分別精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于試管中加蒸餾水至2.0 mL，精密加入蒽酮-硫酸試劑6 mL，置沸水浴中保溫15min，取出。立即放入冰水浴中冷卻15 min，取出。以相應(yīng)試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y= 50.069 0X－0.016 3，r=0.999 1;線性范圍:0.002 5～0.150 0 mg/mL。

2.2.5 樣品含量測定精密量取0.2 mL供試品溶液，加入具塞試管中，置冰水浴中，再精密加入蒽酮-硫酸試劑6mL，然后在沸水浴中保溫15 min，取出，立即放入冰水浴中冷卻15 min，取出，在625 nm波長處測定吸光度，再算含量結(jié)果，葉粗多糖含量為39.6%。

2.2.6 精密度考察精密吸取供試品溶液0.2 mL于5個10 mL容量瓶中，余下操作按“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行，計(jì)算RSD結(jié)果，RSD=1.2%，說明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性考察精密稱取5份同一批粗多糖10mg置25 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度。分別精密吸取供試品溶液0.2 mL于10 m L容量瓶中，余下操作按“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行，計(jì)算RSD，結(jié)果RSD=1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察精密吸取供試品溶液0.2 mL于10 mL容量瓶中，余下操作按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，分別于0、10、20、30、60、90 min測定光度，計(jì)算RSD，結(jié)果RSD=1.9%，表明供試品溶液顯色后90min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)精密吸取供試品溶液0.2 mL共6份，各精密加入0.1 mg/m L對照品溶液0.2 mL，余下操作按“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行，測定光度，計(jì)算加樣回收率為100.5%。

2.3 榅桲葉中多糖的純化

2.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理精密稱取6種［酰胺(14-30)、聚酰胺(30-60)、AB-8、S-8、HPD-100、HPD-400］孔樹脂各5 g，用95%乙醇溶液侵泡24 h，濾出樹脂，用去離子水洗凈至無醇味，然后分別用4% HCI溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至中性，用4%NaOH溶液浸泡4 h，最后用去離子水洗至中性待用［10］。

2.3.2 靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)［11-12］根據(jù)榅桲葉中多糖的吸附率、解吸率和脫色率來選擇合適的樹脂純化多糖。分別稱取經(jīng)預(yù)處理的6種干大孔吸附樹脂各1 g置100mL錐形瓶中，加50mL 1.0mg/mL榅桲葉子粗多糖溶液，每隔10 min振搖1次，連續(xù)5次后靜置24 h。濾出樹脂，從濾液中精密吸取0.2 mL于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，密加入蒽酮-硫酸試劑6mL，置沸水浴中保溫15 min，取出，立即放入冰水浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光度。測定上清液剩余多糖濃度及色素含量。根據(jù)公式計(jì)算樹脂的吸附率:吸附率(%)=(C0-Ce)/C0×100%［公式中:C0為吸附前溶液濃度(mg/mL);Ce為吸附平衡后溶液濃度(mg/mL)］。

將吸附多糖后的樹脂進(jìn)行解吸，用濾紙吸干吸附后的樹脂表面殘留溶液后，裝入干燥的錐形瓶中，加蒸餾水，每隔10 min振搖1次，連續(xù)5次后靜置24 h解吸，濾出樹脂，測定濾液中多糖含量。按下公式計(jì)算解吸率:解吸率=C1/(C0-Ce)×100%［C1為解吸液濃度(mg/mL)］;根據(jù)吸附前后測定吸光度，按下公式計(jì)算脫色率:脫色率=A1-A2/A1× 100%［式中:A1為脫色前吸光度;A2為脫色后吸光度］。

通過以上結(jié)果篩選出符合試驗(yàn)條件的樹脂類型用于后續(xù)試驗(yàn)，HPD-100非極性樹脂對多糖吸附和解吸能力較強(qiáng)，對色素吸附能力較強(qiáng)，結(jié)果分別為: 56.2%、76.6%和63.0%。因此，綜合考慮吸附率、解吸率及脫色率，初步篩選出HPD-100進(jìn)行下一步試驗(yàn)。純化后榅桲葉中多糖含量為63%，結(jié)果見表1。

表1 各種樹脂吸附率、解吸率和脫色率結(jié)果

3 結(jié)論

蒽酮-硫酸法是測定多糖含量較為經(jīng)典有效的方法之一，但影響該法顯色的因素較多。為了減少試驗(yàn)過程中的誤差，蒽酮-硫酸試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用。大孔徑樹脂色譜是吸附原理和分子篩原理相結(jié)合的新的色譜方法，有利于有效成分高度富集、雜質(zhì)少、縮小劑量。通過本實(shí)驗(yàn)，最終選擇了HPD-100為榅桲葉多糖分離純化的最佳吸附樹脂。HPD-100型大孔吸附樹脂可以使榅桲葉多糖含量達(dá)到63%。

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Content determ ination and purification of polysaccharide in leaves of Cydonia oblonga Mill

Isak Mihray，Umar Anwar
(College of Basic Medical，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Objective Determination of the contentof polysaccharide in Cydonia oblonga Mill leaves and its refining process.Methods By anthrone sulfuric acid method was used to determine the content of polysaccharide in leaves of Cydonia oblonga Mill，comparing the six kinds ofmacroporous adsorption resin of quince leaf polysaccharide adsorption rate，desorption rate and decolorization rate influence，from screened for quince leaf polysaccharide，isolation and purification of resin.Results By static adsorption and desorption experiments，initially identified HPD-100macroporous adsorption resin for the purification of quince leaf polysaccharide is suitable for resin，the adsorption，desorption and decolorization effectbest.The results were 56.2%，76.6%，63.0%，purified in leaves of Cydonia oblonga Mill polysaccharide contentwas 63.0%.Conclusion The optimized purification process is simple and feasible and stable.

Cydonia oblonga Mill，s leaf;polysaccharides;content determination;purification

R917

A

1009-5551(2015)06-0715-03

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.013

2014-06-20］

(本文編輯施洋)

國家自然科學(xué)基金(81260490)

美合日阿依·伊薩克(1988-)，女(維吾爾族)，在讀碩士，研究方向:心血管藥理學(xué)研究。

艾尼瓦爾·吾買爾(1962-)，男(維吾爾族)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:心血管藥理學(xué)研究，E-mail:anwar.umar@126.com。