新疆維吾爾、漢族CD14基因-159C/T多態性與變應性鼻炎關聯分析

胡海芳，范宇琴，王燕，陽玉萍，張華(烏魯木齊市頭屯河區中心醫院耳鼻咽喉科，烏魯木齊830000;新疆醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科，烏魯木齊830054)

新疆維吾爾、漢族CD14基因-159C/T多態性與變應性鼻炎關聯分析

胡海芳1，范宇琴2，王燕2，陽玉萍2，張華2
(1烏魯木齊市頭屯河區中心醫院耳鼻咽喉科，烏魯木齊830000;2新疆醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉科，烏魯木齊830054)

目的探討新疆地區維吾爾、漢族CD14基因多態性與變應性鼻炎的關系。方法選取在新疆醫科大學第一附屬醫院耳鼻喉科和變態反應門診就診的維吾爾、漢族變應性鼻炎患者300例(病例組)與同期體檢中心體檢健康者300例(對照組)。應用SNaPshot SNP分型技術對600例樣本進行SNP位點分型，檢測CD14基因啟動子區的-159位點(rs2569190)。采用病例-對照關聯分析方法進行基因型和等位基因頻率分析。并將新疆地區維吾爾、漢族該位點多態性與北京、重慶、湖北、廣東、臺灣、德國、日本、美國、澳大利亞等不同種群進行比較。結果新疆地區維吾爾、漢族變應性鼻炎組與對照組CD14/-159位點基因型和等位基因分布頻率差異無統計學意義(P＞0.05)。漢族變應性鼻炎組與對照組間基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P＞0.05)。維吾爾族變應性鼻炎組與對照組間基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P＞0.05)。新疆地區人群CD14/-159位點多態性與廣東、德國、美國、澳大利亞人群相比有統計學意義，而與其他種群相接近。結論新疆地區維吾爾、漢族都存在CD14-159C/T多態性，都以CT基因型和T等位基因為主，未發現CD14/-159多態性和變應性鼻炎發病之間的關聯。

維吾爾族;漢族;變應性鼻炎;CD14基因;多態性

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是特應性個體接觸致敏原后由IgE介導的介質(主要是組胺)釋放并由多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應疾病。變應性鼻炎患病率高，且呈上升趨勢，已成為國際關注的全球性疾病。我國針對中心城市人群的初步研究表明，平均自報患病率約為11.1%，不同地區間差異很大［1］，據估計在世界范圍內的患病率為10%～25%［2］，是一類復雜的多基因疾病，嚴重危害人類健康的公共衛生。越來越多的證據表明變應性鼻炎的發病是遺傳與環境因素共同作用的結果。根據被廣泛接受的多基因疾病的“common disease，common variams”假說，變應性鼻炎與多個基因的常見變異有關，其中CD14基因受到了普遍關注。由于啟動子區是調控蛋白表達的關鍵因素之一，因此位于啟動子區的基因多態性具有重要意義，啟動子區的堿基變異能影響啟動子區內核轉錄因子結合位點的數量，是調控CD14基因表達的重要單核苷酸多態性位點，其啟動子區-159位點C/T多態性與AR的發病存在關聯性，但是不同地區的研究結論存在較大的爭議。由于不同人群起源及演化的不同，在獨特的地理環境下，受群體起源、群體穩定性、生活習慣、風俗、文化、環境暴露因子、亞群體結構的不同，即使是同一位點的SNP在同一疾病易感座位上的基因頻率會有很大差別。為此，本研究對新疆地區維吾爾族、漢族部分AR患者和正常人群的CD14基因-159位點SNP分型進行檢測，以探討CD14基因-159C/T多態性與AR發病是否存在關聯。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2009年8月-2010年7月就診于新疆醫科大學第一附屬醫院耳鼻喉科和變態反應門診的變應性鼻炎患者300例(病例組)，其中維吾爾族150例，漢族150例，男女比例為1∶1.05，年齡3～82歲，平均年齡為(39.8±14.1)歲，全部患者無血緣關系。入選標準:診斷符合2009年武夷山會議變應性鼻炎診斷標準［3］。300例患者均需完成以下問卷及試驗:變應性鼻炎病史、藥物及食物過敏史、家族過敏史、前鼻鏡檢查、皮膚阿羅格點刺試驗(變應原試液和點刺針均為德國默克集團Allergopharma公司出品的標準化變應原試液)。選新疆地區常見吸入物幾種變應原:艾蒿、藜、豚草、車前草、霉菌類、樹木類、寄生蟲類(塵螨、粉螨)、禾本類。同時以生理鹽水作陰性對照，組胺作陽性對照。至少1種為(++)或(++)以上為陽性。另選擇在新疆醫科大學第一附屬醫院體檢中心進行體檢的健康者300例(對照組)，為新疆地區常住居民，均無直接血緣關系，均需完成前鼻鏡檢查和皮膚阿羅格點刺試驗陰性者。其中維吾爾族150例、漢族150例，男女比例為1∶1.05，年齡2～76歲，平均年齡為(33.8± 16.3)歲。排除標準:抽血前2 w內服用皮質類固醇及抗組胺藥。兩組性別和年齡比較均差異無統計學意義(P＞0.05)。病例組和對照組都簽有書面同意書，并經疆醫科大學第一附屬醫院醫學研究倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集抽取研究對象空腹肘靜脈血2 mL，加入含EDTA的抗凝管，放置-70℃保存。

1.2.2 模板DNA提取用TIANGEN試劑盒方法提取DNA。提取步驟嚴格按照使用說明進行操作。DNA樣本取1μL，將樣本稀釋到工作濃度5～10 ng/μL。PCR反應體系引物用在線Primer3軟件設計:上游引物5'-GCGCCTGAGTCATCAGGACACT;下游引物5'-AACTCTTCGGCTGCCTCTGACA3'。PCR反應體系(10μL)包含1×GC buffer I(TAKARA)、3.0 mMMg2+、0.3 mMdNTP、1 U Taq DNA聚合酶(Qiagen公司，Inc.)、1μL樣本DNA和1μL PCR上下游引物各1μL。PCR循環程序:95℃2 min;94℃20 s，65～0.5℃40 s，72℃1 min 30 s，共11個循環;94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min，共24個循環;72℃2 min;4℃保存。

1.2.3 PCR產物純化在10μLPCR產物中加入1 U蝦堿酶(SAP)和1 U外切酶Ⅰ(EXOⅠ，Promega)，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min。

1.2.4 SNaPshot多重單堿基延伸反應延伸反應體系(10μL)包括5μL SNaPshot Multiplex Kit (ABI)、2μL純化后多重PCR產物、1μL延伸引物混合物、2μL超純水。PCR循環程序:96℃1 min; 96℃10 s、50℃5 s、60℃30 s，共28個循環;4℃保存。延伸產物純化，在10μL延伸產物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15min。

1.2.5 測序反應取0.5μL純化后的延伸產物，與0.5μL Liz120 Size Standard，9μL Hi-Di混勻，95℃變性5 min后上ABI3130XL測序。SNP分型用GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)來分析。

1.3 基因型和等位基因頻率分析采用病例-對照關聯分析方法進行基因型和等位基因頻率分析。應用公式:等位基因頻率=等位基因陽性數/總基因數(患者數×2)，計算出病例組和對照組CD14基因型頻率和等位基因頻率，并將新疆地區維吾爾族、漢族CD14基因-159位點多態性與北京、重慶［4］、廣東［5］、湖北［6］、臺灣［7］、日本［8］、德國［9］、美國［10］、澳大利亞［11］等不同種群進行比較。

1.4 統計學處理采用SPSS17.0統計軟件包進行統計學分析。兩組CD14基因型和等位基因頻率經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律做吻合度檢驗。應用卡方檢驗比較兩組CD14基因型和等位基因頻率分布，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗病例組與對照組基因型的觀察值和期望值均符合Hardy-Weinberg的平衡法則，吻合度檢驗良好(P＞0.05)。

2.2 病例組與對照組CD14基因型和等位基因頻率分布的比較變應性鼻炎組與對照組-159位點基因型分布均以CT型最常見，其次是TT基因型，T等位基因分布頻率最高，病例組CC、CT、TT 3種基因型頻率分別為16.7%、46.7%、36.7%，對照組CC、CT、TT 3種基因型頻率分別為21.7%、42.7%、36.6%。C、T等位基因分布頻率分別為40%、60%和43%、57%。病例組與對照組之間CD14基因型和等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.3 新疆維吾爾、漢族CD14基因型和等位基因頻率分布的比較維吾爾族、漢族CD14基因啟動子-159位點基因型分布均以CT型最常見，其次是TT基因型，T等位基因分布頻率最高。在同一民族中，維吾爾族病例組與對照組間CD14各基因型和等位基因頻率的分布差異無統計學意義(P＞0.05)，漢族病例組與對照組間基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.4 不同種群地區與新疆地區維吾爾、漢CD14/ -159基因型頻率和等位基因頻率的比較新疆地區人群CD14/-159位點多態性與廣東、德國、美國、澳大利亞人群相比有統計學意義，而與其他種群相接近，見表3。

表1 新疆地區變應性鼻炎和對照組CD14/-159基因型和等位基因頻率分布的比較/例(%)

表2 新疆地區維吾爾、漢族CD 14/-159基因型和等位基因頻率分布的比較/例(%)

3 討論

CD14是人體組織和細菌分泌的類毒素(即脂多糖，lipopolysaccharide，LPS)首先發生反應的受體，在單核巨噬細胞和嗜中性粒細胞表面表達［12］。從免疫學角度看，CD14和LPS之間的相互反應將激活細胞因子IL-12的活性，由此引發以Thl細胞為主體的免疫應答反應，其結果可抑制IgE的產生從而影響變應性疾病的發生［13］。1999年，美國一組研究人員Baldini等［14］發現位于CD14基因啟動子(promoter)-159位點上的多態性(由堿基C變成T)可以增強CD14的活性，并通過激活IL-12的活性而增強Thl細胞功能和降低IgE的產生，高加索白人變應性疾病兒童CD14基因的CC和CT基因型血清總IgE水平較TT型高，而可溶性CD14較TT低，顯示C等位基因與變應性疾病有關。關于AR與CD14基因研究較多，但結果各異。Han等［15］調查中國北京成年人變應性鼻炎患者TT純和子較CC和CT基因型常見，CD14 C-159 T多態性與血漿IgE水平無關。Kang等［16］發現CD14基因-159位點多態性在韓國兒童常年變應性鼻炎的發展過程中具有重要作用，CC基因型與CT和TT基因型比較有高的皮膚點刺陽性率和高的血漿IgE水平。Kowal等［17］研究CD14多態性與氣道反應性不同有關，與IgE反應有關。PAl-1和CD14相互作用影響變應性哮喘的易感性。隨著世界各國研究人員加入這一研究行列，也有相當一部分研究結果發現這些CD14基因多態性與CD14的活性及變應患者(鼻炎和哮喘)血清總IgE濃度和癥狀無關。而且，多態性的發生率在不同種族人群中有差異［18-19］。將新疆地區維吾爾族、漢族該位點多態性與北京、重慶、廣東、湖北、臺灣、日本、德國、美國、澳大利亞等不同種群進行比較，結果顯示，新疆地區人群CD14/-159位點多態性與廣東、德國、美國、澳大利亞人群相比差異有統計學意義，而與其他種群相接近。有幾個原因解釋這些矛盾:能力的缺乏;連鎖不平衡;基因和基因的相互作用;人群混居、基因與環境的相互作用。如果這個SNP與編碼蛋白的功能改變有關，就能調節變應性疾病的易感性。這種影響可能是適度的依賴于其他共同存在的特定種群、遺傳和環境危險因素［20］。

表3 不同種族人群CD14基因-159基因型和等位基因分布頻率的比較/例(%)

本研究采用病例-對照研究方法，在新疆維吾爾族和漢族人群中，對CD14基因-159C/T位點多態性與變應性鼻炎的關系進行了研究，未證實基因多態性與維吾爾族、漢族變應性鼻炎的發病有關聯。研究結果與國內外的報道有相同之處，也有不同之處。其原因:(1)變應性鼻炎是一種具有遺傳傾向的多基因疾病，有多個候選基因，每個基因又是微效基因，不能明確是由某個基因主導。(2)環境因素與遺傳因素相互作用，兩者的多樣性表現出AR不同的表現型和異質性。特別是近3年基因與環境的相互作用已經成為哮喘和變態反應性疾病遺傳學的主旨［21］。(3)種族差異、地域差異以及研究多態性方法的不同也是研究結果不一致的原因之一。(4)樣本量的大小、性別匹配以及抽樣誤差亦是造成研究結果不一致的原因。綜上所述，新疆地區維吾爾族和漢族在AR的發病上可能存在有其他未知的遺傳或環境因素對AR的發病起著作用。但對CD14基因與AR的確切關系以及它是如何與其它致病基因相互作用引發AR的，仍有待進一步研究。

致謝:感謝上海天昊遺傳分析中心的工作人員對本研究給予的幫助和支持!

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Association of CD14 gene-159C/T polymorphism with allergic rhinitis in Xinjiang Uyghur and Hans

HU Haifang1，FAN Yuqin2，W ANG Yan2，YANG Yuping2，ZHANG Hua2
(1Department of Otorhinolaryngology，Toutunhe Center Hospital，Urumqi 830000，China;2Department of Otorhinolaryngology，The First Affliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi830054，China)

Objective To investigate the relationship between the CD14 gene-159C/T polymorphisms and allergic rhinitis(AR)in Xinjiang Uyghur and Hans populations.Methods Three hundred individuals had AR and 300 were healthy controls.We identified the CD14/-159 SNP used SNaPshot technical.The case-control analysis was adopted the frequencies of genotypes and alleles.The distribution of genotype frequencies and allele in the Chinese Xinjiang Uyghur and Han population were compared with other different populations from Beijing，Chongqing，Hubei，Guangdong，Taiwan，Germany，Japan，the United States，and Australia.Resu lts The distribution of genotypes or alleles of CD14gene-159C/T had no differences between the AR group and the control group in both the Xinjiang Uyghur and Hans populations(P＞0.05).The frequencies of genotypes and alleleswere not different between the Han AR and Han control group(P＞0.05).The frequencies of genotypes and alleleswere not differentbe-tween the Uyghur AR and Uyghur control group(P＞0.05).The distribution of genotype frequencies and allele of CD14-159C/T in the Chinese Xinjiang Uyghur and Han population are quite different from Chinese Guangdong Han populations，American，German and Australian(P＜0.05).Conclusion The CD14/-159C/T polymorphismswere not different between the Chinese Xinjiang Uyghur and Han population.Themajor genotype frequencies and allele were both CT and T.No relationship between CD14/-159 SNP and AR was found.

Uyghur ethnic;Han ethnic;Allergic Rhinitis;CD14 gene;polymorphism

R765.21

A

1009-5551(2015)06-0664-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.002

2014-12-10］

(本文編輯楊晨晨)

國家自然科學基金(30860310)

胡海芳(1975-)，女，碩士，副主任醫師，研究方向:耳鼻咽喉疾病診治。

張華，女(維吾爾族)，博士，主任醫師，教授，博士生導師，研究方向:耳鼻咽喉疾病基礎與臨床防治研究，E-mail:hzhang1106@163.com。