血管性癡呆大鼠模型制作方法的改良

顧靜，李海龍，楊長生，車敏，吳紅彥，*

（1.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，蘭州 730000；2.甘肅省中醫方藥挖掘與創新轉化重點實驗室，蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產品創制工程實驗室，蘭州 730000)

研究報告

血管性癡呆大鼠模型制作方法的改良

顧靜1，3，李海龍2，楊長生2，車敏3，吳紅彥2，3*

（1.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，蘭州 730000；2.甘肅省中醫方藥挖掘與創新轉化重點實驗室，蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產品創制工程實驗室，蘭州 730000)

目的對血管性癡呆（VD)大鼠模型的造模方法進行改進，使血管性癡呆的實驗研究更加科學可靠。方法 采用“反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久結扎頸總動脈法”制備VD大鼠模型，并用腦復康（吡拉西坦)加以模型驗證。實驗從大鼠行為學和組織病理兩個方面評價VD模型。結果實驗結果顯示:對比假手術組，模型組大鼠定位航行潛伏期延長，空間搜索穿越平臺次數減少，海馬病理切片顯示:細胞數量較少、細胞輪廓模糊皺縮、胞質深染、核不清晰；腦復康陽性藥物對照組上述指標明顯改善。結論硝普鈉注射量為2.0 mg/ kg時，手術室溫控制在28℃且術后24 h內控制在25℃，大鼠狀態穩定，死亡數減少；術中反復阻斷三次雙側頸總動脈后直接永久性結扎左側頸總動脈，可以切斷大約三分之一的腦供血，造成慢性腦供血不足狀態，更接近VD發病機制。

血管性癡呆；大鼠模型；吡拉西坦；腦；海馬；外科手術；病理學

血管性癡呆（vascular dementia，VD)是由腦血管病（如腦梗塞、腦出血、皮層下白質的缺血性改變)引起的以記憶、認知功能缺損為主的獲得性智能持續性損害。病理變化可見腦實質細胞凋亡，數目減少，腦縮小。近年來血管性癡呆已成為我國中老年人的多發病。但目前國內外對控制本病病程進展尚無有效方法和藥物，因此急需相關基礎研究以開發有效藥物，相應的VD動物模型構建至關重要。

大鼠與人類有相似的腦血管解剖學結構，腦供血系統由頸動脈系和椎底動脈系合成動脈環，通過分支完成腦供血。建立準確、高真的VD大鼠模型，對深入探討VD的病因病機、病理學特點以及早期診斷和防治具有重要意義。近年來有關血管性癡呆模型制作的研究不斷完善，制作方法多樣，例如常用的有:兩血管阻斷法及改良法（2-VO)[1-5］、三血管阻斷法（3-VO)[6，7］、四血管阻斷法（4-VO)、大腦中動脈梗死法、血管栓塞法、VD自發模型[8，9］和去大腦皮層法等多種方法，各種方法仍有弊端，例如:關于“硝普鈉注射量，環境溫度要求，反復阻斷再灌注造成短暫性腦缺血，術后大鼠可能會恢復”等問題有待改良。為了使血管性癡呆實驗更加科學，VD大鼠模型制作更易成功，本研究參考分析上述這些造模方法并做一改進，采用“反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久結扎頸總動脈法”制備血管性癡呆大鼠模型，并用腦復康（吡拉西坦)加以模型驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級Wistar大鼠30只，體重240～260 g，60日齡，來源于甘肅中醫學院科研實驗動物中心【SCXK（甘)2011-0001-62001000000062】，無菌手術在甘肅中醫學院科研實驗動物中心進行【SYXK（甘)2013-0001-00000077】。飼料由甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供。多聚甲醛等基礎試劑購自天津科化，腦復康（吡拉西坦膠囊，陜西白鹿制藥股份有限公司)，腦復康藥液的配制:用雙蒸水配制成濃度為0.09 g/mL水溶液，4℃儲存備用；水合氯醛（上海化學試劑五聯化工廠)，用生理鹽水配制成10%注射液；注射用硝普鈉（湖南中南科倫藥液有限公司)，用雙蒸水配制成濃度0.8 mg/mL注射液，避光保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 血管性癡呆（VD)大鼠模型制備

采用反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久性結扎頸總動脈法。大鼠術前禁食、水，用10%水合氯醛麻醉，常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈，模型組及藥物治療組在夾閉雙側頸總動脈之前，腹腔注射硝普鈉（2.0 mg/kg)，隨即用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，隨后去除動脈夾通血10 min，共間歇阻斷—再通雙側頸總動脈血流3次，之后結扎一側頸總動脈，縫合傷口、保溫飼養。假手術組僅分離雙側頸總動脈·。術后肌注慶大霉素預防感染。

1.2.2 動物分組及給藥

大鼠隨機分為3組:假手術組（空白對照組)、模型組、陽性對照組（腦復康)。陽性對照組給予腦復康灌胃（0.324 g/kg)，假手術組、模型組給予等量生理鹽水，每日一次，連續灌胃23 d。

1.2.3 Morris水迷宮行為學檢測

Morris水迷宮可用于檢測大鼠空間學習記憶能力。分為定位航行實驗和空間搜索實驗兩部分。訓練開始時將大鼠任意從四個象限之一面向池壁入水，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間（逃逸潛伏期)。每次大鼠共游120 s尋找平臺，若成功找到給予15 s休息時間，若未找到，將其引至平臺也休息15 s，逃逸潛伏期為120 s。連續訓練4 d，上午2次，下午2次。第5天撤去平臺，將大鼠面向池壁放入水中找記憶平臺，每只大鼠限時游60 s，記錄其60 s內游過原平臺相應位置的次數。數據采集和處理由Morris迷宮圖像自動監視處理系統完成。

1.2.4 海馬組織病理切片觀察

禁食12 h頸椎脫臼處死大鼠，使頭置于冰塊上開顱取出腦，冰盤上剝離取出大腦皮質及海馬，保存于-80℃備用。

將海馬放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋；海馬區石蠟切片、脫蠟、復水、蘇木素染色；鹽酸乙醇分化、伊紅復染、乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 M orris水迷宮行為學檢測結果

水迷宮定位航行實驗結果如表1，圖1A、1B（圖中亮色曲線是大鼠在水池中的游動軌跡，圖21游動軌跡越短說明大鼠用越短的時間爬上平臺，即逃逸時間越短；圖1B游動軌跡穿越平臺區（圖中最小圓形區)次數越多說明在一定時間大鼠找到平臺的次數越多。根據圖片顯示大鼠認知能力與數據分析結果趨勢一致。)顯示:模型組與假手術組比較，大鼠逃逸潛伏期明顯增長（5.7倍)，差異有顯著性（★P＜0.05)，與模型組比較陽性對照組大鼠逃逸潛伏期縮短了35.2%，差異有顯著性（▲P＜0.05)；空間搜索實驗結果顯示:模型組與假手術組比較，大鼠穿越平臺次數顯著減少了70%，差異有顯著性（★P＜0.05)，與模型組比較陽性對照組大鼠穿越平臺次數增加了1倍左右，差異有顯著性（▲P＜0.05)。

2.2 海馬組織病理切片觀察

根據大鼠海馬病理切片顯示的神經細胞特點，從細胞輪廓、細胞數量、胞質深染程度、胞核清晰度等4個方面描述評價神經細胞損傷程度。每個觀察指標按下述標準依次評分為1、2、3分，各指標累計評分越高表示細胞損傷越嚴重。

根據表2，圖2大鼠海馬病理切片分析:假手術組4個觀察指標海馬神經細胞損傷合計為4分，模型組為12分，陽性對照組為10分（模型組和陽性對照組圖中圈內為細胞固縮深染主要區域)。因此大鼠海馬病理切片分析結果顯示:與假手術組比較，模型組海馬神經細胞數量較少、細胞輪廓模糊皺縮、胞質深染、核不清晰，損傷嚴重；與模型組比較，陽性對照組海馬神經細胞損傷程度均有好轉。

表1 水迷宮檢測（±s)Tab.1 Results of watermaze test

表1 水迷宮檢測（±s)Tab.1 Results of watermaze test

注:與假手術組比較★P＜0.05，與模型組比較▲P＜0.05。Note.Compared with the control group，★P＜0.05；compared with themodel group，▲P＜0.05.

空間搜索次數Number of space search假手術組Sham operated group 7 9.3±3.25 5.0±0.82模型組Model group 6 62.3±3.67★1.5±0.55★陽性對照組Positive control group 5 40.4±2.61★▲3.0±1.00★▲組別Groups n 定位航行潛伏時間/s Navigation latency time

表2 病理切片細胞損傷評分表Tab.2 Scores of the cell damage assessment

3 討論

3.1 常用VD大鼠模型復制法分析

西醫認為血管性癡呆病因主要是腦血管病變引起供血不足而致腦組織缺血缺氧性改變，最終使大腦功能全面衰退。基于這一基本理論，目前VD大鼠模型構建也多采用腦血管阻斷或輔以其他減少腦血流的方法制備動物模型。下面針對目前常用的VD大鼠模型的制作方法進行優劣分析。

3.1.1 兩血管阻斷法（2-VO)

2-VO法是將大鼠雙側頸總動脈 （common carotid artery，CCA)永久性結扎，使大腦處于慢性低灌注狀態，造成海馬區、皮層等缺血缺氧損傷。此法操作簡便卻存在較高的死亡率。

3.1.2 2-VO改良法

這種改良法又包括以下四種:①分次結扎頸總動脈法:分兩次結扎頸總動脈，間隔一星期，此方法能降低動物死亡率，且大鼠海馬區變性、壞死程度與2-VO法變相似[1，2］；②2-VO法聯合高血脂癥:高脂飼料喂養大鼠一個月，確定血脂升高后再用2-VO法，此方法模擬了高脂血癥引發 VD的發病機制[3，4］；③腎血管高血壓法:夾閉大鼠雙側腎動脈，造成腎血管性高血壓模型，43 d后阻斷再通雙側頸總動脈。此模型與人類高血壓腦動脈損害相似；④反復阻斷-再灌注聯合并腹腔注射硝普鈉:夾閉雙側CCA之前，腹腔注射硝普鈉降低血壓，加重腦缺血損傷，反復夾閉—再灌注三次，每次間隔10 min，此方法穩定，操作簡便創傷小而且存活率高，但應該注意此方法對硝普鈉注射量、環境溫度要求較高[5］。

圖1 水迷宮記憶功能檢測軌跡圖Fig.1 Watermazememory testing path chart

圖2 海馬組織病理切片（HE，×40)Fig.2 Histological changes of the hippocampal tissue

3.1.3 三血管阻斷法（3-VO)

該方法阻斷大鼠基底動脈與雙側頸總動脈，制成一種慢性腦供血不足，優點是缺血迅速，再灌注血流迅速恢復，適用于急性全腦缺血性VD研究，但缺點是手術創傷大，大鼠存活率低[6，7］。

3.1.4 四血管阻斷法（4-VO)

先阻斷大鼠雙側椎動脈，再可逆性阻斷雙側頸總動脈，結果海馬等部位受損嚴重，但該法操作復雜，難度高，創傷嚴重，大鼠生存率很低。

3.1.5 大腦中動脈梗死法

從頸總動脈切口插線經至MCA，實現MCA阻塞，導致腦缺血，該法缺血效果可靠，MCA供血區有典型的神經細胞壞死，但操作技巧要求高，創傷大，死亡率高。

3.1.6 血管栓塞法

本方法采用外源性栓子從大鼠一側頸動脈注入大鼠體內，造成多發性腦梗，致缺血性中風。

3.1.7 VD自發模型

自發性高血壓大鼠 （spontaneously hypertensive rat，SHR)亞系自發性高血壓腦卒中傾向大鼠（stroke-prone，SHR)能夠很好模擬長期高血壓與持續低灌注共同導致的VD，與長期高血壓后中風VD高度相似，是比較理想的VD模型，但與非高血壓VD發病情況不一致，而且來源限制性，價格昂貴等原因限制此方法在實驗中的應用[8，9］。

3.1.8 去大腦皮層法

大腦皮層法是將除去大鼠軟腦膜血管，模型可使大鼠皮質、海馬等處細胞造成損傷，貼切的模擬了VD病理改變，缺點是打開硬腦膜時對動物損傷過大，導致動物死亡率高。

3.2 “反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久結扎頸總動脈法”制備血管性癡呆大鼠模型

通過對VD大鼠模型制作方法的研究，我們認為“2-VO改良法—反復阻斷再灌注聯合腹腔注射硝普鈉法”重復性、穩定性好，操作簡單，對動物創傷小，存活率高，并且與VD發病機制相似，但應該注意兩點:第一，此方法對硝普鈉注射量、環境溫度要求較高；第二，考慮反復阻斷再灌注造成短暫性腦缺血，術后大鼠可能會恢復。基于此方法我們采用“反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久結扎頸總動脈法”制備血管性癡呆大鼠模型，通過設立藥物陽性對照組觀察大鼠行為學、組織病理學等指標分析模型構建情況。以下是本法對“2-VO改良法—反復阻斷再灌注聯合腹腔注射硝普鈉法”兩個問題的改良和分析:

第一，關于“硝普鈉注射量、環境溫度要求”的問題改良:本實驗開始前進行了預實驗，摸索硝普鈉的注射條件，發現硝普鈉注射量按文獻2.5 mg/ kg[5］的量過大，所以對硝普鈉劑量進行了實驗研究。實驗分3個組制作VD模型，每組15只大鼠，注射硝普鈉劑量分別為2.5、2.0 mg/kg和沒有注射硝普鈉，其他方法3組一致。結果2.5 mg/kg組大鼠死亡率高達73%，2.0mg/kg組大鼠死亡率降至40%，沒有注射硝普鈉組大鼠死亡率為33%，和2.0 mg/ kg組接近，因此確定硝普鈉注射量為2.0 mg/kg時，手術時室溫控制在28℃，術后24 h內控制在25℃時大鼠狀態穩定，死亡數減少。

第二，關于“反復阻斷再灌注造成短暫性腦缺血，術后大鼠可能會恢復”問題的改良:手術中反復阻斷三次雙側頸總動脈后直接永久性結扎左側頸總動脈，這樣可以切斷大約三分之一的腦供血，造成慢性腦供血不足狀態，更接近VD發病機制。

另外需要說明的是，大鼠在水迷宮實驗檢測行為記憶功能時，由于重復性實驗會使動物記憶功能受反復學習因素的影響，通過多次強化訓練，其空間搜索和定位航行能力提高，所以比較同只（組)大鼠在造模前與造模后的行為記憶功能是不客觀、不符合實驗需求的。因此本實驗采用假手術組與模型組造模后的組間比較，不進行同只（組)的造模前后比較。

通過術后大鼠行為學和病理學檢測，造模手術后水迷宮定位航行實驗結果顯示造模組較假手術組大鼠逃逸潛伏期明顯增長，而空間搜索實驗結果顯示在一定時間內模型組大鼠穿越平臺區次數少于假手術組，說明模型組大鼠學習記憶能力較假手術組顯著降低；HE病理切片也顯示模型組較假手術組海馬區神經元細胞多數皺縮、消失，細胞間隙增寬、排列紊亂，部分神經元細胞胞核固縮，神經細胞凋亡程度高于假手術組，證明采用“反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久結扎頸總動脈法”制造血管性癡呆大鼠模型比較理想。陽性對照藥物腦復康干預后，以上各指標均有改善，驗證了此模型可有效用于同類藥物的開發和基礎研究。

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Improvement of themethod to establish a ratmodel of vascular dementia

GU Jing1，3，LIHai-long2，YANG Chang-sheng2，CHE Min3，WU Hong-yan2，3
（1.Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology and Toxicology in Gansu Province，Lanzhou 730000，China；2.Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation in Gansu Province，Lanzhou，730000；3.Labortory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province，Lanzhou 730000.)

ObjectiveTo improve themethod to establish a ratmodel of vascular dementia and to better serve the experimental studies on vascular dementia.MethodsWe used themethod of“repeatedly clipping the carotid artery combined with injection of sodium nitroprusside and with permanentunilateral carotid artery ligation”to prepare a ratmodel of vascular dementia.The drug piracetam was used to validate the established ratmodel in respectof the behavior and histopathology.ResultsDifferent from the reports of previous research，firstly，the results of this study suggested that injection dose of sodium nitroprusside should be 2.0 mg/kg，room temperature should be controlled at 28℃ during surgical operation，and keptat25℃postoperatively for24 hours.Under these experimental conditions，the ratswere stable and the death rate was reduced.Secondly，“repeatedly clipping carotid artery combined with permanentunilateral carotid artery ligation”could cut off about a third of cerebral blood supply，and causing chronic cerebral ischemia，which is seeminglymore consistentwith the pathogenesis of vascular dementia.Experimental results showed that compared with the control group，the navigation incubation period was extended and space search ability became worse in themodel group，cell number was decreased，with blurred cell contour and deeply stained cytoplasm，and cell nucleiwere not clear in the hippocampal tissue.ConclusionsOur findings indicate that the improved method＂repeatedly clipping the carotid artery combined with injection of sodium nitroprusside and with permanent unilateral carotid artery ligation＂can be used to efficiently establish a rat model of vascular dementia.The similar results of experiment using piracetam validate that this ratmodel can be used invascular dementia-related experimental studies.

Vascular dementia；Ratmodel；Piracetam；Brain；Hyppocampus；Surgery；Pathology

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0634-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.017

2015-06-16

甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室自主課題（ZDSYS-ZZKJ-2013（B)-004)；國家自然科學基金（81060284)。

顧靜（1980-)，女，副教授，博士，主要從事心血管藥理生理學研究。Email:120233234@qq.com

吳紅彥（1963-)，男，教授，博導，主要從事老年病學研究。Email:gujing120233234@126.com