大鼠椎間盤髓核細胞體外凋亡模型的建立

王厚磊，盧偉，李德芳，丁磊，吳靖平

（復旦大學附屬金山醫院骨科，上海 201508)

研究報告

大鼠椎間盤髓核細胞體外凋亡模型的建立

王厚磊，盧偉，李德芳，丁磊，吳靖平*

（復旦大學附屬金山醫院骨科，上海 201508)

目的建立大鼠椎間盤髓核細胞體外凋亡模型。方法為了充分模擬退變椎間盤內營養缺乏的微環境，本實驗分別采用含1%，3%，5%，8%，10%胎牛血清的DMEM培養基培養椎間盤髓核細胞，篩選最佳促凋亡濃度，分別檢測髓核細胞凋亡率、凋亡相關蛋白Bax、bcl-2、caspase-3酶的表達、細胞增殖曲線及免疫熒光分析。結果流式細胞儀測得髓核細胞凋亡率隨著胎牛血清（FBS)濃度降低而升高，3%FBS為最有效誘導凋亡濃度；Western blot示Bax、caspase-3酶表達在3%FBS組明顯高于10%FBS組，同時bcl-2表達下降；CCK-8檢測結果顯示含3%FBS的培養基內，隨著凋亡率的增長，髓核細胞增殖的速率越來越慢；免疫熒光分析3%FBS組FAS表達量明顯比10%FBS組增高。結論3%FBS能誘導髓核細胞發生凋亡，最終會導致細胞功能喪失，caspase家族參與并執行了這一過程。

椎間盤退變；髓核細胞；凋亡；營養奪獲；大鼠

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD)是椎間盤退變性疾病發生的前提條件和病理基礎，是中老年人的常見病和多發病。IVDD是引起中老年腰背痛的主要原因之一[1］。椎間盤退變的主要病理變化為髓核細胞變性、壞死，髓核細胞外基質分泌減少，逐步引起椎間盤基質蛋白多聚糖和水分的丟失，進一步導致膠原構成改變[2］。而有研究稱髓核細胞所產生的II型膠原、蛋白多聚糖和其他細胞外基質成分對維持椎間盤的完整性具有重要作用[3，4］。髓核組織異常是引起椎間盤退變的主要因素，髓核組織過早出現纖維化，逐漸引起纖維環裂縫，從而加速椎間盤退變[5］。目前，椎間盤退變的確切發病機制及病理變化過程仍不明確[6］。構建理想的體外椎間盤細胞退變模型對研究椎間盤退變的發生機制，減緩或逆轉其發病過程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

DMEM高糖型培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司，美國)；Hoechst 33258、二甲基亞砜DMSO（Sigma公司，美國)；annexin V-FITC/PI雙染試劑盒（BD，美國)；caspase-3、bcl-2、Bax抗體、二抗（CST公司，美國)；蛋白上樣緩沖液、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天公司，中國)；培養瓶、培養板（Corning公司，美國)；發光液（Millipore公司)；CO2細胞培養箱超凈工作臺（上海力申科學儀器有限公司，中國)；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本)；流式細胞儀（BD公司，德國)。

1.1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠10只，10周齡，雌雄各半，體重150～200 g，來源于上海市公共衛生臨床中心【SCXK（滬)2010-0024】，無菌手術在上海市公共衛生臨床中心實驗動物科學部屏障動物實驗設施進行【SYXK（滬)2010-0098】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠椎間盤髓核細胞的分離與培養

10周齡SD大鼠，雌雄各半，水合氯醛腹腔麻醉后頸椎脫臼法處死，常規消毒，無菌條件下取下整個腰椎，解剖顯微鏡下剝離椎間盤周圍筋膜和肌肉并顯露椎間盤，將脊柱標本用預先準備的無菌PBS液清洗2次，用尖刀片輕輕刮除椎間盤上層軟骨終板，顯露軟骨終板之間的膠凍樣組織，細針輕輕挑出并放入盛有培養基的培養皿中，剪碎為0.5 mm3左右組織塊，1000 r/min，5 min離心，離心后用PBS液沖洗3次，采用序貫消化法獲取髓核細胞，以約2×104的密度接種于培養瓶中，將培養瓶置于含5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養，進行換液、傳代、鋪板，隨機進入各實驗分組。

1.2.2 建立低胎牛血清椎間盤髓核細胞凋亡模型

按照本課題組預實驗方法建立髓核細胞凋亡模型。傳代細胞隨機進入各實驗分組，分為5組:1%胎牛血清（FBS)組、3%FBS組、5%FBS組、8%FBS組、10%FBS組，檢測各組的凋亡率，再進一步行分子生物學檢測。

1.2.3 流式細胞儀檢測軟骨終板細胞凋亡

采用annexin V-FITC聯合PI法進行檢測樣本。結果判斷:聯合應用annexinV-FITC和PI對培養體系中的細胞進行染色，annexinV（-)/PI（-)代表健康活細胞，annexin V（+)/PI（-)代表早期凋亡細胞，annexin V（+)/PI（+)代表晚期凋亡細胞和壞死細胞。在不同濃度血清下培養48 h后，收集各孔培養基的上清液（其中包含漂浮細胞)，貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，二者混合后進行離心棄上清，孵育annexin V-FITC與PI染色劑，上機進行凋亡率檢測，本實驗中凋亡細胞包括早期和晚期凋亡細胞，實驗獨立重復三次。

1.2.4 Western blot檢測caspase-3、Bax、bcl-2表達

流式篩選凋亡率最高的組別作為實驗組，完全培養基10%FBS組作為對照組，傳代培養48 h后，去除各孔培養基，用預冷PBS液清洗一次，洗凈PBS后每孔加入RIPA裂解液80μL冰上裂解30min，混勻，收集裂解液4℃下14 000 r/min離心20 min取上清液，并測定蛋白濃度，取50μg蛋白與上樣緩沖液混合煮沸8 min，電泳、轉膜、封閉，4℃時孵育一抗caspase-3（1∶1000)、Bax（1∶5000)、bcl-2、（1∶2000)稀釋液，孵育二抗，曝光，以β-actin作為內參。

1.2.5 細胞增殖的檢測

收集處于對數增長期的髓核細胞，以4×103/孔接種于96孔板。每組3個復孔。培養于37℃、5%CO2的培養箱內，分別在第0、12、24、48 h檢測細胞活性。按照CCK-8試劑盒說明書操作步驟，每孔中加入10μL CCK-8試劑，混勻后于孵箱中孵育2 h，然后在酶標儀中測定450 nm波長的光吸收值。以上實驗重復三次。

1.2.6 免疫熒光檢測

細胞接種在培養皿中，每孔接種1×105個細胞，24 h后棄去培養基，PBS清洗、4%多聚甲醛固定、0.2%Triton X-100對細胞透化處理、1%FBS濃度PBS封閉，一抗稀釋液室溫孵育1 h，二抗稀釋液避光孵育1 h，Hoechst33258染核，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.7 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，所有的實驗獨立重復三次，數據分布以均數±標準差（±s)表示，進行成對樣本的獨立t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 髓核細胞凋亡率

流式細胞儀結果顯示:1%FBS組凋亡率（10.62 ±1.33)%，3%FBS組平均凋亡率（35.84± 1.05)%，5%FBS組凋亡率（20.15±0.75)%，8% FBS組凋亡率為（10.99±1.63)%，10%FBS組凋亡率（1.05±0.96)%，與其四組比較，3%FBS組凋亡率明顯增高，差異有顯著性（P＜0.05)（圖1)。

2.2 凋亡相關蛋白檢測

以3%FBS組與10%FBS組分別作為實驗組和對照組，Westernblot對凋亡相關蛋白的檢測顯示，βactin作為內參，與對照組相比，實驗組促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達均較高，而抗凋亡蛋白bcl-2表達降低。3%FBS組細胞凋亡，灰度差異有顯著性（P＜0.05)，實驗達到預期效果（圖2)。

2.3 細胞增殖檢測

CCK-8檢測結果顯示:與10%對照組細胞相比，隨著培養時間的增加，3%FBS組細胞活性逐漸降低，說明細胞在含3%FBS的培養基內，隨著凋亡率的增長，細胞活性越來越低（圖3)。

2.4 免疫熒光檢測

FAS在細胞內分布的熒光染色:FAS在細胞中平均分布的定量分析顯示，3%FBS組顯色強度比10%FBS組的增強（圖4)。FAS是細胞表面重要的死亡受體，與其配體結合后活化并傳導凋亡信號，表明3%FBS組可能通過死亡受體途徑凋亡。

3 討論

椎間盤退行性疾病是臨床上常見病之一，其發病機制至今仍未闡明，被認為是多因素共同作用而導致。目前仍未找到有效的治療途徑緩解椎間盤退變。因此，從細胞分子水平研究其機制，從而找到有效治療途徑成為研究的焦點之一。本課題組著重研究建立可靠模型模擬椎間盤退變時細胞分子學改變，探究其明確發病機制。

圖1 流式細胞儀檢測髓核細胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rates of the nucleus pulposus cells detected by flow cytometry

構建椎間盤退變細胞模型的方法有很多，比較常見的有化學誘導法和物理誘導法。國外學者研究證實[7］過量的激光照射傳代培養的細胞系，會引起DNA堿基突變，導致核酸遺傳物質改變，最終導致細胞凋亡。國內研究也發現[8］，隨著不同劑量梯度紫外線的照射，細胞中凋亡相關蛋白的表達會不斷增加；化學試劑誘導法是在細胞培養體系中加入特定化學試劑，常見的有硝普鈉（SNAP)[9］、白細胞介素-1β（IL-1β)[10］、過氧化氫（H2O2)[11］、抗 FAS抗體[12］等，這些構建椎間盤細胞凋亡模型都能用于研究椎間盤退變時的細胞分子學改變，但按照上述方法建模時，不僅對細胞本身造成了直接損傷，同時改變了細胞生存的微環境，不能充分模擬椎間盤內部低營養代謝狀態。本課題組先前已用此實驗方法建模[13］，并取得良好效果。此方法不僅能夠充分模擬椎間盤退變時內環境變化對細胞造成的影響，而且此方法重復性高，經濟成本低。

圖2 各組的caspase-3、Bax、bcl-2表達變化Fig.2 Changes of the expression of caspase-3，Bax，bcl-2 in each group

圖3 髓核細胞增殖檢測Fig.3 Test of the nucleus pulposus cell proliferation

圖4 大鼠髓核細胞熒光染色圖（×10)Fig.4 Fluorescence staining of the rat nucleus pulposus cells（×10)

隨著實驗研究的深入，目前已發現[14，15］，椎間盤退變是在多種復雜因素共同作用下，引起髓核細胞過度凋亡，使蛋白多聚糖、水分等合成不足，最終導致椎間盤退行性改變，并且退變椎間盤內髓核細胞凋亡率是正常狀態的2～3倍。髓核細胞作為椎間盤的重要組成部分，主要維持椎間盤的正常結構及功能，過度凋亡的髓核細胞會破壞椎間盤的穩定，使其發生退變，可見髓核細胞凋亡是椎間盤退變的重要因素[16-18］。

近來，國外研究證實[19］營養物質缺乏是導致椎間盤退變的直接因素，也是導致IVDD的最重要因素。椎間盤作為體內的無血管組織，其營養供應途徑主要如下[20，21］:（1)終板途徑:椎體內血管的營養物質和代謝廢物均可經軟骨終板滲透到椎間盤內外，軟骨終板發揮中介作用，營養髓核及內層纖維環；（2)纖維環途徑:纖維環表面血管營養其外側1/ 3。當營養物質缺乏時，髓核細胞的數量及活性受到顯著影響，進而導致椎間盤的退變。通過模擬椎間盤內營養缺乏導致椎間盤退變的內環境，本實驗成功構建了椎間盤退變髓核細胞的體外模型，能更好的模擬體內椎間盤退變時髓核細胞所發生的分子學變化。以annexin V-FITC/PI雙染色檢測其凋亡率時發現，隨著胎牛血清濃度的降低，髓核細胞凋亡率逐漸增加，3%FBS組細胞凋亡率較其余四組明顯增高；Western blot發現3%FBS狀態下髓核細胞Bax、caspase-3明顯升高、而bcl-2明顯下降。Bax/bcl-2比值與細胞凋亡關系密切，Bax表達增高時，不僅可形成Bax/Bax同二聚體，誘導細胞凋亡，而且促進caspase-3的活化，但 bcl-2能抑制細胞凋亡[22，23］。Caspase-3作為凋亡執行性酶，能夠調節細胞分化、增殖，活化后的caspase-3不斷切割底物，逐步放大蛋白酶級聯切割過程，最終激活核酸酶裂解核小體間的DNA，形成凋亡小體，導致細胞凋亡[24，25］。

隨著年齡的增長，椎間盤外周微血管數量會逐漸減少，椎間盤細胞的營養物質供應逐漸減少而代謝廢物逐漸堆積，乳酸大量沉積導致pH值下降，椎間盤細胞活性受損，最終導致椎間盤細胞凋亡。因此，本課題組認為3%FBS導致髓核細胞活性降低，細胞外基質成分的含量及含水量等減少，導致椎間盤力學性質及穩定性下降，從而引起椎間盤退變。

目前，對于椎間盤退變的研究主要集中于軟骨終板及纖維環，而體外髓核細胞凋亡模型的建立更是鮮有報道。本實驗介紹的建模采用3%FBS培養方法充分模擬體內椎間盤營養缺乏狀態下髓核細胞的改變，篩選3%FBS濃度既能滿足髓核細胞的基礎代謝，也能獲得較好的凋亡率效果，本模型不但證實了髓核細胞凋亡的存在，而且還發現在營養缺乏條件下髓核細胞凋亡很可能是通過死亡受體途徑實現的。本實驗采用3%FBS培養法處理髓核細胞成功建立體外髓核細胞凋亡模型，并初步探討髓核細胞的凋亡機制，為進一步研究髓核細胞凋亡機制及干預措施提供了基礎。

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Establishment of an apoptosismodel of rat disc nucleus pulposus cells in vitro

WANG Hou-lei，LUWei，LIDe-fang，DING Lei，WU Jing-ping*
（Department of Orthopedics，Jinshan Hospital of Fudan University，Shanghai201508，China)

ObjectiveTo develop an apoptosismodel of nucleus pulposus cells in cell culture.M ethodsTo mimic the nutrient-deficientmicroenvironmentof degenerative intervertebral disc，nucleus pulposus cells derived from infant SD rat disc were cultured under serum limiting conditions.Nucleus pulposus cellswere cultured in culturemedium containing 1%，3%，5%，8%and 10%fetalbovine serum（FBS)respectively to select the optimum FBA concentration.Apoptosis was assessed by flow cytometry，Western blot，cell counting kit，and immunofluorescence technique.ResultsThe flow cytometry revealed that apoptosis rate of the nucleus pulposus cells increased with decreasing concentration of FBS，and 3% FBSused in the experimentalgroup was themosteffective concentration to induce apoptosis（P＜0.05).Western blotdemonstrated significantly higher expression of Bax and caspase-3 enzyme in the 3%FBS group than in the 10%FBS group，while bcl-2 activity decreased.The results of CCK-8 test indicated that the nucleus pulposus cells gotslower proliferation in themedium containing 3%FBS.Immunofluoresence analysis showed that FASexpression was significantly higher in the 3% FBS group than in the 10%FBS group.Conclusions3%FBS condition may induce apoptosis in the nucleus pulposus cells and compromise the cell function to induce intervertebral disc degeneration.The caspase family should be involved in the process.

Intervertebral disc degeneration；Nucleus pulposus cells；Apoptosis；Nutrition deprivation；Rat

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0607-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.012

2015-06-24

上海市衛生局科研項目（編號:2012-341)。

王厚磊（1989-)，男，骨科碩士在讀、研究方向為椎間盤退變預防與治療，E-mail:13211270011@fudan.edu.cn

吳靖平，主任醫師，碩士生導師，研究方向為椎間盤退變預防與治療，E-mail:drwujp@126.com