宮頸癌中長鏈非編碼RNA CRNDE表達及其臨床意義

韓懿 勞美瓊 雷巧如 李艷娜

長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）是一類不編碼蛋白、轉錄本長度超過200 nt的非編碼RNA分子。近年來發現LncRNA與X染色體沉默、染色體修飾、轉錄激活與抑制、RNA剪切等有關，在胚胎與組織發育、細胞分化、神經代謝性疾病、腫瘤等中發揮重要功能［1-3］。越來越多的證據顯示LncRNA在腫瘤的發生發展中起著重要作用，是腫瘤診斷和治療新的研究前沿［4-5］。研究發現，LncRNA CRNDE（colon rectal neoplasia differentially expressed）在結直腸癌、膠質瘤等多種腫瘤中表達明顯升高，提示其與腫瘤的發生發展密切相關，但其生理功能和作用機制尚不明確［6-7］。關于LncRNA CRNDE在宮頸癌中的功能研究，目前國內外相關報道較少。本研究通過比較LncRNA CRNDE在宮頸癌組織及癌旁組織中表達，分析其與患者臨床預后的關系，為LncRNA CRNDE用于宮頸癌診斷、治療及預后評估提供理論依據，為尋找新的宮頸癌腫瘤標志物提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集2009年10月至2014年10月87例廣東省開平市中心醫院行手術切除的宮頸癌患者的癌組織與對應的癌旁組織標本，所有標本均經病理學檢查確診為宮頸癌，標本獲取前全部病例均未行化療和放療，臨床資料完整。87例宮頸癌患者的年齡為24～60歲，中位年齡為40歲；年齡＜40歲患者為44例，年齡≥40歲為43例；Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期20例；鱗癌68例，腺癌19例；無淋巴結轉移35例，淋巴結轉移52例。65例患者接受了手術，60例患者接受了放化療。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 隨訪 全部患者出院后均進行隨訪，方式為電話和門診隨訪，內容包括一般情況、臨床癥狀和影像學檢查。隨訪起點為病理確診日期，末次隨訪時間為2015年3月31日，截止隨訪終止患者生存41例、死亡46例，無失訪病例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 Trizol試劑盒、AMV逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、LncRNA CRNDE引物均購自中國上海Invitrigeng公司。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法 收集宮頸癌組織及癌旁組織（50～100 mg）標本，放入液氮冷凍后，鋁箔包裹，在研缽中充分研磨，用Trizol試劑反復洗滌研磨后的碎末，經焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理后凍存管收集，放入液氮中，提取RNA進行檢測。在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨（樣品總體積不超過所用Trizol體積10%），移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。取上述準備的RNA，逆轉錄反應參照AMV逆轉錄試劑盒說明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進行cDNA合成。采用LncRNA CRNDE基因特異性引物CRNDE-FW2及CRNDE-RV2進行RT-PCR，以GAPDH作為內參照。LncRNA CRNDE上游引物為5'-GCGGAG GTTAAGTGT-3'，下游引物為5'-AACAGGTTTACCTCCT TATCTTCAGAA-3'；內參照GAPDH上游引物為5'-GGA AGGACTCATGACCACAGTCC-3'，下游引物為5'-TCGC TGTI'GAAGTCAGAGGAGACC-3'。比較宮頸癌組織與癌旁組織中LncRNA CRNDE基因表達的變化。實驗重復3次。LncRNA CRNDE相對表達量（RQ）=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照=（Ct樣品LncRNA CRNDECt樣品GAPDH）-（Ct對照LncRNA CRNDE-Ct對照GAPDH）。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。宮頸癌組織與癌旁組織中LncRNA CRNDE差異表達采用t檢驗；LncRNA CRNDE表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗。LncRNA CRNDE表達與患者生存期關系采用Kaplan-Meier法，采用Cox比例風險模型用于宮頸癌預后的多因素分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA CRNDE在宮頸癌組織中表達及其與患者的預后關系

RT-PCR檢測LncRNA CRNED在87例宮頸癌組織和癌旁組織中表達，結果提示LncRNA CRNED在宮頸癌組織中表達為3.974±0.981，明顯高于癌旁組織1.237±0.325，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖1）。

LncRNA CRNED表達與患者年齡、腫瘤大小、病理類型、腫瘤分化、FIGO分期、淋巴結轉移和腫瘤浸潤深度等臨床病理特征的關系見表1。LncRNA CRNED表達與患者的FIGO分期、淋巴結轉移和腫瘤浸潤深度相關，差異具有統計學意義（P＜0.05），而與患者的年齡、腫瘤大小、組織來源和分化程度無關（P＞0.05）。2-ΔΔCt≤1定義為低表達，2-ΔΔCt＞1為高表達［8］。

圖1 LncRNA CRNDE在宮頸癌及癌旁組織中表達Figure1 Expression of LncRNA CRNDE in cervical cancer and paraneo?plastic tissue

表1 LncRNA CRNDE表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

表1 LncRNA CRNDE表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 （續表1）Table 1 Association between LncRNA CRNDE expression and different clinicopathological features of human cervical cancers

2.2 LncRNA CRNDE表達對患者生存期的影響

采用Kaplan-Meier法分析LncRNA CRNDE表達與患者生存期關系，結果發現LncRNA CRNDE高表達患者的生存時間較低表達者明顯縮短，差異具有統計學意義（χ2=16.185，P＜0.001，圖2）。

圖2 LncRNA CRNDE表達水平與患者生存期關系Figure 2 Correlation between Kaplan-Meier survival curves and Ln?cRNA CRNDE level

Cox回歸多因素分析發現FIGO臨床分期、淋巴結轉移和腫瘤侵潤深度及LncRNA CRNDE表達可作為宮頸癌患者獨立的預后因子（表2）。

表2 Cox多因素分析患者的臨床病理特征與預后的關系Table 2 Cox multivariate analysis for correlation between clinicopatho?logical features and prognosis in patients

3 討論

宮頸癌是全世界婦女中發病率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤，也是最常見的生殖道惡性腫瘤，嚴重威脅女性健康。近40年來其發病率卻及死亡率已有明顯下降，但年輕女性宮頸癌的發病率卻有明顯上升趨勢，已引起國內外學者的關注。雖然多數的早期宮頸癌可經手術或放療等手段而治愈，但其中20%～25%病例卻因復發和遠處轉移而導致治療失敗，因此宮頸癌的預后也是不容忽視的問題［9-10］。LncRNA是一類不編碼蛋白、轉錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA分子，可在多層面上（表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等）調控基因的表達，其功能目前尚不完全清楚［11］。近年來的研究表明，LncRNA以RNA形式在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平調控基因的表達，廣泛參與調控個體的生長發育以及細胞凋亡、增殖、分化等生命活動，并且還參與了人類癌癥、心血管疾病和神經退行性疾病等病理進程，LncRNA的研究已成為現代分子生物學領域研究的重要熱點［5，12-13］。2011年發現的LncRNA CRNDE是結直腸腫瘤差別表達基因，在結直腸癌以及多種腫瘤組織中表達上調［14］，其轉錄產物只有較低的編碼蛋白能力，因此將其歸為長鏈非編碼RNA。LncRNA CRNDE定位于16號染色體IRX5基因的反義鏈上，與其共用一個雙向啟動子。LncRNA CRNDE基因全長約10 kb，包含5個核心外顯子和1個出現頻率較低的附加外顯子［15］。該基因存在著多種可變剪接，至少存在十幾種轉錄本，其中一些轉錄本中存在不同的內含子序列。目前研究發現，LncRNA CRNDE在許多癌組織或細胞（實體腫瘤及白血病）中表達明顯升高，其中在膠質瘤中LncRNA CRNDE上調14～32倍［16］。本研究發現LncRNA CRNED在宮頸癌組織中表達明顯高于癌旁組織，與LncRNA CRNED在結直腸癌和腦膠質瘤中表達的結果一致［6，14］。此外，本研究還發現，LncRNACRNED表達與患者的FIGO分期、淋巴結轉移和腫瘤侵潤深度相關，LncRNA CRNDE高表達患者的生存期較低表達者明顯縮短，Cox多因素分析發現LncRNA CRNDE表達可作為宮頸癌患者獨立的預后因子。

總之，本研究將為LncRNA CRNDE應用于宮頸癌的診斷、治療及預后提供理論依據，為尋找宮頸癌腫瘤新的標志物提供思路。

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