藏紅花有效成分含量比較與相關性研究

朱芳萍 呂偉旗 張青蓮 吳春美

藏紅花有效成分含量比較與相關性研究

朱芳萍 呂偉旗 張青蓮 吳春美

目的 比較藏紅花有效成分含量及影響因素，為藏紅花高產優質栽培與優良種質選育提供依據。方法 在2010年版藥典與現有文獻基礎上，優化藏紅花有效成分含量HPLC測定方法，并測量比較11個產地藏紅花中有效成分含量，用DPS軟件分析經緯度、海拔與有效成分含量間的相關性。結果 西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ分別在6.236～62.356μg/mL以及3.158～31.584μg/mL范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系，R2分別為0.9997與0.9996，兩者平均回收率分別為99.9%（RSD=1.69%，n=9）與99.4%（RSD=0.86%，n=9）；11個產地藏紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、西紅花總苷含量存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）；經度與西紅花有效成分含量呈正相關關系，海拔、緯度與西紅花有效成分含量呈負相關關系。結論 本方法測定藏紅花有效成分含量簡便、準確、重復性好，我國引種的藏紅花有效成分含量高，質量好，低緯度、高經度地區并視種質選擇海拔高度區別種植藏紅花有利于有效成分積累。

藏紅花；有效成分；含量；相關性

藏紅花crocus sativus L.學名西紅花、番紅花，系鳶尾科番紅花屬植物，原產西班牙、伊朗等地，因其經印度轉入西藏再銷往國內各地而得名[1]。花柱上部及柱頭入藥，具有強烈的活血化瘀和散郁開結之功效，是有效的婦科良藥，治療婦女閉經、產后瘀血腹痛有獨特療效[2-4]。西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ是2010年版《藥典》規定的藏紅花主要有效成分，藥理學研究表明，藏紅花具有改善微循環，提高免疫力，抗動脈硬化，抗氧化，降血脂，利膽保肝，防治骨質疏松，保護腎臟等功效[5-10]。藏紅花在我國浙江、河南、上海、江蘇、新疆、西藏等地均有栽培，因栽培地南北跨度大，不同產地栽培的藏紅花在物候期、農藝性狀、有效成分含量等方面存在差異。筆者收集了全國主要產區11批樣品，采用HPLC法對不同產地藏紅花進行西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量測定，并分析了經緯度、海拔與有效成分含量間的相關性，以期為藏紅花高產栽培與質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Waters1525高效液相色譜儀：1525μ泵、2487雙波長紫外檢測器、7725Ⅰ型手動進樣器、Breeze3.0版的色譜工作站（美國Waters公司）；KQ5200DE型數控超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司，機型：Milli-Q Academic）；DGG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

西紅花苷-Ⅰ對照品（Crocin-Ⅰ，純度＞97%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-11071108）；西紅花苷-Ⅱ對照品（Crocin-Ⅱ，純度＞98%，成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-11091002）；甲醇（色譜級，德國Merck公司）；乙醇（分析級，安特公司）；水為去離子水，其它試劑均為分析純。供試藥材2012年10月—2012年11月采自浙江、江蘇、河南、上海等不同產地，經麗水市人民醫院副主任藥師吳春美鑒定為鳶尾科番紅花屬植物番紅花crocus sativus L.的柱頭，詳見表1。

表1 供試不同產地藏紅花藥材統計

1.2 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱Agligent eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm，4.6μm）；流動相為甲醇∶水（48∶52，V/V），采用等度洗脫條件，時間為45min；流速：1.0mL/min；檢測波長：440nm；柱溫：35℃；進樣量：20μL。按上述色譜條件，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀。

1.3 溶液制備

1.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ對照品適量，置25mL容量瓶中，用50%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻。得濃度為0.624mg/mL的西紅花苷-Ⅰ對照品溶液和0.316mg/ mL的西紅花苷-Ⅱ對照品溶液，置于4℃冰箱避光保存，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末10mg，置25mL容量瓶中，加適量50%乙醇溶解，40℃超聲處理30min，放至室溫，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45μm微孔膜濾過即得。

1.4 線性關系考察 分別取對照品西紅花苷-Ⅰ（0.624mg/mL）與西紅花苷-Ⅱ（0.316mg/mL），移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL容量瓶中，加50%乙醇稀釋定容，在“1.2.1”色譜條件下測定。以西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ對照品溶液的質量濃度為縱坐標x，峰面積為橫坐標y繪制標準曲線。計算得西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ線性范圍分別為6.236～62.356μg/mL以及3.158～31.584μg/mL，回歸方程以及相關系數分別為：y=388.87x-33.547，R2=0.9997；y=392.94x-144.5，R2=0.9996，見表2。

1.5 穩定性試驗 取8號樣品，按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液，放入適宜的開口容器中，置于以下條件保存：①高溫度試驗：40℃，避光；②高濕度試驗：室溫，相對濕度（90±5）%，避光；③強光照射試驗：室溫，（4500±500）Lux光照強度下照射。分別于0、2、4、6、8、10、12、24進樣，在“1.2.1”色譜條件下測定峰面積，計算得各條件下西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD（n=8）值，結果表明供試品溶液在強光照射條件下不穩定，在高溫度、高濕度避光保存條件下24h內穩定，見表3。

1.6 精密度試驗 取同一標準品溶液，在“1.2.1”色譜條件下連續進樣5次，測得西紅花苷-Ⅰ的色譜峰面積RSD=0.88%，西紅花苷-Ⅱ的色譜峰面積RSD= 1.67%，表明儀器精密度良好，見表4。

表2 西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ線性關系考察

1.7 重復性試驗 取8號樣品5份，按“1.2.2.2”供試品溶液的制備操作，在“1.2.1”的色譜條件下測定含量，得西紅花苷-Ⅰ的平均含量為10.88%，RSD為1.28%，西紅花苷-Ⅱ的平均含量為3.53%，RSD為1.24%，見表5。

1.8 加樣回收率試驗 取已知西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量的西紅花樣品10mg，9份，分低、中、高三組，每組3份，分別加入西紅花苷-Ⅰ（0.624mg/ mL）對照品溶液各0.90，0.75和0.50mL；西紅花苷-Ⅱ（0.316mg/mL）對照品溶液分別加入0.49、0.41和 0.33mL，按照“1.2.2.2”供試品溶液的制備操作，按“1.2.1”色譜條件進樣測定，計算回收率（%）=（C-A）/ B×100%，A為樣品中被測成分的含量，B為加入對照品的量，C為實際測得含量。結果見表6，西紅花苷-Ⅰ的平均回收率為99.9%，RSD為1.69%；西紅花苷-Ⅱ的平均回收率為99.4%，RSD為0.86%。

1.9 樣品含量測定 精密稱取樣品適量，按“1.2.2.2”供試品溶液的制備操作，在“1.2.1”的色譜條件下對不同產地11個藏紅花樣品進行西紅花苷含量測定，重復3次，計算總苷含量=西紅花苷-Ⅰ含量+西紅花苷-Ⅱ含量。

表3 穩定性試驗

表4 精密度試驗

表5 重復性試驗（%）

表6 加樣回收率試驗結果

2 結果與分析

2.1 藏紅花有效成分含量HPLC法優化 分別對西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ色譜峰進行吸收光譜掃描，結果發現西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ色譜峰在440nm波長處有最大吸收，與2010年版《藥典》中西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ的測定波長一致。因此，選擇440nm作為西紅花苷-Ⅰ與西紅花苷-Ⅱ的檢測波長。在現有研究基礎上[8，11-13]，對西紅花苷提取工藝進行了優化，分別考察了乙醇濃度為40%、50%、60%，提取時間為20、30、40min，提取溫度為30、40、50、60℃對西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ提取含量的影響，結果表明，用50%乙醇，40℃條件下超聲30min即可提取完全，且操作簡便、快捷，供試品溶液中雜質成分含量低，不干擾待測成分的檢驗。同時比較了幾種不同流動相比例，發現以甲醇：水=48：52（V：V）為流動相較好，選用的流動相條件使得西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ兩個化合物的峰行好，出峰時間早，分離度好。色譜圖見圖1。

2.2 11個產地藏紅花有效成分含量比較 不同產地藏紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ與總苷含量存在差異（P＜0.05，P＜0.01），浙江產藏紅花中西紅花總苷含量較高，其中最高為浙江建德1樣品，總苷含量達到18.48%，江蘇與河南產藏紅花中西紅花總苷含量相對較低，江蘇太倉與河南三門峽樣品含量最低，總苷含量僅為12.35%，詳見表7。我國藏紅花主產地浙江、江蘇、河南、上海所產藏紅花中西紅花總苷含量均達到2010年版藥典要求（總苷含量不低于10.0%），總苷平均含量達14.92%。從有效成分含量看，我國引種藏紅花較為成功，所產藏紅花品質好，長江三角洲地區較適合藏紅花選育栽培，為藏紅花良種選育奠定了基礎。

2.3 海拔、經緯度與有效成分相關性分析 產地的立地條件對中藥材藥效成分的積累具有一定影響，包括海拔、年平均氣溫、經緯度、光照等。本試驗分析顯示，藏紅花產地海拔、經緯度與有效成分含量存在相關性，其中經度與西紅花有效成分含量呈正相關關系，海拔、緯度與西紅花有效成分含量呈負相關關系；緯度與有效成分含量間相關性最大，相關系數分別達到西紅花苷-Ⅰ含量（0.61712）、西紅花苷-Ⅱ含量（0.67684）、西紅花總苷含量（0.67503），見表8。從各指標相關性看，低海拔、低緯度、高經度地區種植藏紅花有利于有效成分含量積累。

表7 不同產地藏紅花中西紅花苷含量比較（%）

3 討論

藏紅花性平，味甘，歸心、肝經，主要功效為活血化瘀，涼血解毒，解郁安神，用于經閉癓瘕，產后瘀阻，溫毒發斑，憂郁痞悶，驚悸發狂。同時，藏紅花又可用于開發功能性食品、天然色素、保健化妝品等，再次成為人們研究開發的熱點，但是藏紅花資源極其有限，致使價格昂貴，一直被譽為“植物黃金”。我國醫藥所需的藏紅花主要依靠進口，雖然進行引種栽培，提供少量商品，但因種源少，適宜栽培的地區有限，栽培技術要求較高等綜合因素，滿足不了市場的需求，出現了供不應求的局面。收集我國藏紅花主產區藏紅花栽培資源，進行有效成分含量比較、經緯度等相關性分析，對篩選藏紅花優良種質，高產優質栽培等研究均有重要意義。

圖1 高效液相色譜圖A.西紅花苷-Ⅰ對照品；B.西紅花苷-Ⅱ對照品；C.供試樣品；1.西紅花苷-Ⅰ；2.西紅花苷-Ⅱ

表8 海拔、經緯度與有效成分含量相關性分析

實驗結果表明，我國藏紅花主產區所產藏紅花中主要有效成分均符合2010年版《藥典》中西紅花總苷含量不得少于10%的要求；11個產地藏紅花中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ與總苷含量均存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），浙江產藏紅花中西紅花總苷含量較高，江蘇與河南產藏紅花中西紅花總苷含量相對較低；經度與西紅花有效成分含量呈正相關關系，海拔、緯度與西紅花有效成分含量呈負相關關系。試驗結果顯示低海拔、低緯度、高經度地區種植藏紅花有利于西紅花總苷含量積累，但是低海拔地區藏紅花進入盛花期時間往往比高海拔地區推遲半個月，這樣反倒不利于產量的提高，也延遲了大田移栽期，減少了大田生長時間，不利于來年種球生長。因此，藏紅花高產優質栽培需綜合考慮干花成品、種球的質量與產量，同時結合栽培地不同立地條件與不同藏紅花種質的特性多方面考慮。據筆者多年調查研究藏紅花大田生長習性與室內開花習性，并結合本試驗可知，我國長江中下游地區所產藏紅花種質，種球生長所需大田應位于低緯度地區，室內培育開花場地應視具體種質而定，長江中下游種質室內培育開花位于中高海拔地區，而河南等北方種質應位于低海拔地區，這樣可提高藏紅花有效成分積累，增加種球質量與產量。

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（收稿：2014-08-06 修回：2014-11-18）

Com parison of the Active Com ponent Contents in Crocus Sativus and Their Correlation w ith Site Condi-tion

ZHU Fangping,LV Weiqi,ZHANG Qinglian,WU Chunmei.Department of Pharmacy,the Six Hospital affiliated to Wenzhou Medical University,Lishui(323000),China

Objective To detect the active component contents in Crocus sativus and investigate the influence factor on them,in order to provide scientific basis for high yield and quality cultivation of Crocus sativus and selection of good germ plasm.M ethods Based on China Pharmacopeia published in 2010 and the existing evidence, the HPLC method for determination of active component contents in Crocus sativus was optimized.The active component contents in Crocus sativus planted in 11 different producing area were determined and compared.DPS software was used to find the relationship between latitude,longitude,height,and the active components.Results The linear ranges of crorin-I and crorin-II were 6.236-62.356μg/mL and 3.158-31.584μg/mL,the R2 were 0.9997 and 0.9996,and the average recovery rates were 99.9%（RSD=1.69%,n=9）and 99.4%（RSD=0.86%,n=9）,respectively.Significant difference in crorin-I,crorin-II,and total contents was found between Crocus sativus produced in different areas（P＜0.05 or P＜0.01）.A positive correlation was seen between active component contents and the longitude of producing area;a negative correlation was seen between active component contents and the latitude and height of producing area.Conclusion The optimized HPLC method for determining the active component contents in Crocus sativus is convenient,accurate,and repeatable.The quality of Crocus sativus cultivated in China is high. Cultivation of Crocus sativus in areas with low latitude,high longitude and varied heights according to different germplasm will be benefit.

Crocus sativus;Active components;Content;Correlation

溫州醫科大學附屬第六醫院藥劑科（麗水市人民醫院）（麗水 323000）

吳春美，Tel：0578-2292513