小兒止瀉巴布劑體外抑菌及皮膚刺激性試驗

王京霞 陳 琳 高瑞蘭

·論 著·

小兒止瀉巴布劑體外抑菌及皮膚刺激性試驗

王京霞 陳 琳 高瑞蘭

目的 對小兒止瀉巴布劑進行體外抑菌及皮膚刺激性試驗，為其臨床應用提供實驗依據。方法 采用平皿法觀察小兒止瀉巴布劑浸膏對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢桿菌的抑菌效果從而確定最低抑菌濃度；應用新西蘭兔完整皮膚及破損皮膚進行試驗，考察小兒止瀉巴布劑對新西蘭兔皮膚刺激性反應。結果 小兒止瀉巴布劑最低抑菌濃度（MIC）：金黃色葡萄球菌100mg/mL，大腸埃希菌400mg/mL，銅綠假單孢桿菌800mg/mL。新西蘭兔完整皮膚組多次給藥后兩側皮膚無紅斑水腫，破損皮膚組出現輕度紅斑及輕度水腫。結論 小兒止瀉巴布劑有一定的抑菌作用，對新西蘭兔完整皮膚無刺激性,對破損皮膚有輕度刺激性。

新西蘭兔；小兒止瀉巴布劑；體外抑菌；最低抑菌濃度；皮膚刺激性試驗

小兒腹瀉是一組由多病原、多因素引起的以大便次數增多和大便性狀改變為特點的消化道綜合征。小兒止瀉巴布劑是在經典方藥止瀉散基礎上研制而成，該散劑源于北宋中醫兒科鼻祖錢乙創制的七味白術散，記載在《小兒藥證直訣》中[1]，外敷臍部治療小兒腹瀉臨床療效好。在此基礎上我們研制一種療效確切、安全可靠、質量可控及使用方便的小兒止瀉巴布劑。本文對小兒止瀉巴布劑進行了體外抑菌及皮膚刺激性試驗，為臨床安全合理用藥提供科學實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動 物 健康雄性新西蘭白兔，體質量1.9～2.2kg。浙江省實驗動物質量合格證號：0009290，來源：浙江省新昌縣大市聚鎮欣健兔場[生產許可證號：SCXK（浙）2010-0042]。

1.2 主要藥品及試劑 小兒止瀉巴布劑浸膏（每mL含生藥3.2g，批號：20131211）；小兒止瀉巴布劑（規格：3cm×3cm，批號：20140131）；小兒止瀉巴布劑空白對照（規格：3cm×3cm，批號：20140130）；以上試驗樣品由浙江省中醫院制劑中心提供。營養肉湯培養基（批號：20130109-00）購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 菌 種 大腸埃希菌（escherichia coli）CMCC（B）44102，傳代數：第3代，傳代日期：20131115；金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，傳代數：第3代，傳代日期：20131115；銅綠假單孢桿菌（pseudomonas aeruginosa）CMCC（B）10104傳代數：第3代，傳代日期：20131220；以上菌種均購自浙江省食品藥品檢驗研究院。

1.4 主要儀器 FA-1104電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；JJ200/d=0.01g電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；SPX-150B-Z微電腦生化培養箱、MJX-160B-Z微電腦霉菌培養箱及SW-CJ-1BU單人水平潔凈工作臺（上海博迅實業有限公司）；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器（上海華線醫用核子儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 小兒止瀉巴布劑體外抑菌試驗

2.1.1 試驗用菌液的制備[2]接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，30～35℃培養24h。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數為100cfu的菌懸液，備用。菌懸液在室溫下放置2h內使用。

2.1.2 樣品倍比稀釋 按常規試管法，取小兒止瀉巴布劑浸膏（含生藥3.2g/mL），用營養肉湯作對比稀釋（1600mg/mL、800mg/mL、400mg/mL、200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL），每管2mL，另留不含藥液的肉湯作空白對照，高壓滅菌后備用。

2.1.3 最小抑菌濃度（MIC）測定[3-4]取生長后的每種菌液用3～5mL 0.9%無菌氯化鈉溶液校正濃度至0.5麥氏比濁標準，再用營養肉湯稀釋1：10，稀釋后的菌液盡快在30min內接種。用微量加樣器每管加入0.1mL肉湯菌液，依次由低濃度到高濃度加入試管中，菌液與含藥肉湯混勻后于37℃生化培養箱中培養24h，然后從每個藥液稀釋度的試管和對照試管中分別取一接種環接種在營養肉湯瓊脂平皿上，放于培養箱中37℃培養24h，以不顯示細菌生長的那一管的藥液濃度作為最小抑菌濃度（MIC）。

2.2 皮膚刺激性試驗[5-9]將16只新西蘭兔平均分成4組：完整皮膚藥物組、破損皮膚藥物組、完整皮膚空白組和破損皮膚空白組。采用同體左右側自身對比法，進行相同備皮面積的完整皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗。給藥前將新西蘭兔脊椎兩側對稱部位去毛，去毛后24h檢查去毛皮膚是否受傷，受傷的皮膚不能進行完整皮膚的刺激性試驗。

破損皮膚組將脫毛部位用注射針頭劃“#”字并以出現滲血為度。左右兩側皮膚的破損程度基本一致。左側貼小兒止瀉巴布劑，右側貼空白基質，將小兒止瀉巴布劑用無刺激性的醫用膠布固定，每天給藥1次，每次給藥時間相同，連續給藥7天。給藥期間及末次貼敷去除藥物后1、24、48和72h在自然光線下肉眼觀察皮膚反應并記錄給藥部位有無紅斑和水腫情況，按照表1進行評分。皮膚刺激強度評價：0.00～0.49分，無刺激性；0.50～2.99分，輕度刺激性；3.00～5.99分，中度刺激性；6.00～8.00分，重度刺激性。

表1 皮膚刺激性反應及評分（分）

3 結 果

3.1 體外抑菌試驗 小兒止瀉巴布劑的最小抑菌濃度（MIC）：金黃色葡萄球菌為100mg/mL，大腸埃希菌為400mg/mL，銅綠假單孢桿菌為800mg/mL。見表2。

表2 小兒止瀉巴布劑抑菌試驗結果

3.2 皮膚刺激性試驗 完整皮膚多次給藥后新西蘭兔皮膚刺激性反應平均分值均＜0.5分；破損皮膚藥物組多次給藥后皮膚刺激性反應最高分值為0.75分，破損皮膚空白組多次給藥后皮膚刺激性反應最高分值為0.75分，反應強度均在0.50～2.99分之間。提示小兒止瀉巴布劑對新西蘭兔完整皮膚無刺激性，對破損皮膚有輕度刺激性，見表3。

表3 小兒止瀉巴布劑皮膚刺激性評分（分）

4 討論

小兒止瀉巴布劑是在七味白術散基礎上研制而成的小兒外敷巴布劑，用于小兒腹瀉。據文獻記載，七味白術散是對多種腸道疾病有很好療效的經典方[10]，結合其外敷給藥方式，我們選擇了常用3種致病菌：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌，對小兒止瀉巴布劑體外抑菌作用進行了研究，考察其對三種致病菌的抑菌效果。該制劑用于小兒，而小兒皮膚比較細嫩，根據“藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則[11]”中相關要求，我們選擇新西蘭兔對其進行了多次給藥的皮膚刺激性試驗。結果顯示，小兒止瀉巴布劑有一定的抑菌作用，對新西蘭兔完整皮膚無刺激性，對破損皮膚有輕度刺激性。為臨床前藥物安全性評價提供實驗數據。

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（收稿：2014-10-03 修回：2014-12-29）

Antibacterial Effect and Skin Irritation Reaction of Xiao'er Zhixie Cataplasm in vitro

WANG Jingxia,CHENLin,GAORuilan. PreparationCenter,theFirstHospitalaf filiatedtoZhejiangChineseMedicalUniversity, Hangzhou（310053）,China

Objective To investigate the antibacterial effect and skin irritation test of Xiao'er Zhixie cataplasm in vitro to provide experimental basis for its clinical application.M ethods Xiao'er Zhixie cataplasm was extracted by culture dish method and cocultured with Escherichia Coli,Staphylococcus Aureus,and Pseudomonas Aeruginosa to determine the minimum inhibitory concentrations（MICs）.New Zealand rabbits were divided into intact skin group and damaged skin group to test irritation reaction with Xiao'er Zhixie cataplasm.Results The MICs of Xiao'er Zhixie cataplasm on Escherichia Coli,Staphylococcus Aureus,and Pseudomonas Aeruginosa were 100,400,and 800 mg/mL,respectively.No erythema and edema was observed on both sides skin of New Zealand rabbits in the intact skin group after multiple dosing,while the damaged skin group appeared mild erythema and edema.Conclusion Xiao'er Zhixie cataplasm has some antibacterial effect,no irritation to rabbits'intact skin,and mild irritation to damaged skin.

New Zealand rabbits;Xiao'er Zhixie cataplasm;Bacteriostasis in vitro;Minimum inhibitory concentration;Skin irritation test

浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2014ZB030）

浙江省中醫藥大學附屬第一醫院制劑中心（杭州310053）通信作者：王京霞，E-mail：962039277@qq.com