高壓氧預處理對大鼠腸缺血再灌注機械屏障損傷的影響

代皓，鄭磊，朱洪智，楊艷梅，陳凱

(1武警四川總隊醫院成都分院，成都610000;2滄州醫學高等專科學校;3武警醫學院附屬醫院)

腸道是應激的中心器官。在創傷、休克、嚴重感染時，全身血液重新分布，引起腸道嚴重缺血、缺氧性損害，隨后的再灌注進一步加重腸道機械屏障功能破壞，嚴重者可以導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多臟器功能障礙綜合征(MODS)［1］。高壓氧預處理可以減輕多臟器的缺血再灌注損傷。2013年9月～2014年6月，我們利用經典的夾閉腸系膜上動脈的方法［2］復制大鼠腸道缺血再灌注損傷模型，觀察高壓氧預處理對正常及急性腸缺血再灌注機械屏障損傷大鼠的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠30只，體質量250～300 g(北京維通利華公司)，雌雄不拘。PBS(Sigma，美國)，葡聚糖藍-2000(Sigma，美國)，髓過氧化物酶活力檢測試劑盒(BioVision，美國)，TNF-α ELISA試劑盒(Sigma，美國)，甲醛(北京鼎國公司)，50%戊二醛(北京鼎國公司)。透明動物加壓艙(上海楊園醫用氧艙廠)，透射電子顯微鏡(Hitachi公司，日本)，ELx800光吸收酶標儀(BIOTEK，美國)，體視顯微鏡(Olympus，日本)，低溫離心機(Sigma，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將大鼠按隨機數字表法分為假手術組(不阻斷腸系膜上動脈，其他處理同缺血再灌注組)、缺血再灌注組(阻斷腸系膜上動脈并再灌注)和高壓氧預處理組(阻斷高壓氧預處理后阻斷腸系膜上動脈并再灌注)各10只。實驗前適應性喂養1周，22～25℃室溫，普通飼料喂養。

1.2.2 高壓氧預處理方案 高壓氧預處理組動物置加壓艙，艙底置新鮮鈉石灰，純氧洗艙10min，使艙內 O2濃度 ＞98%，CO2濃度 ＜0.05%，以0.1 MPa/min的速度加至0.25 MPa(絕對壓)，高壓停留60min(期間以純氧通風10min)，艙內溫度維持在22～24℃。暴露結束后，勻速減壓15min至常壓，出艙。2次/d，進艙時間分別為8:00和15:00，連續暴露2 d。實驗過程中如有死亡，采用同標準的大鼠用同樣的辦法補充。

1.2.3 腸缺血再灌注模型建立 大鼠術前禁食12 h，自由飲水。備皮后常規麻醉、消毒、鋪巾，上腹部沿正中線切口，暴露并在根部游離腸系膜上動脈，用小動脈夾夾閉，腸管還納腹腔，腹部切口閉合，缺血45min后，從原切口再次入腹，松開腸系膜前動脈夾再灌注1 h。

1.2.4 腸道動力測量 缺血再灌注后，在距離大鼠的屈式韌帶1cm處空腸內注入葡聚糖藍-2000 0.4 mL，30min后大鼠頸椎脫臼處死，取出全部空腸測量空腸中葡聚糖藍-2000推進距離及空腸全長，計算空腸推進率(葡聚糖藍-2000推進距離/空腸全長×100%)。

1.2.5 TNF-α測定 用無熱源注射器抽取大鼠肝門靜脈血適量，取掉針頭貼壁注入無熱源管中;靜置30min，離心 5min(3 500 r/min)，取得血清，使用TNF-α ELISA試劑盒，通過酶標儀測得492 nm處OD值，根據樣品OD值，使用標準曲線公式換算出相應樣品中TNF-α含量。

1.2.6 腸組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定 在距離回盲部1cm處取1cm長小腸，用冷生理鹽水沖洗，清除黏液、污物等腸腔內容物后進行勻漿。使用髓過氧化物酶活力檢測試劑盒，通過酶標儀測得412 nm處OD值;根據樣品OD值使用標準曲線公式換算出相應樣品中MPO含量。

1.2.7 光鏡及透射電鏡觀察 在距離回盲部2cm處取1cm長小腸，用4%甲醛液固定，經梯度乙醇系列脫水，二甲苯透明后，常規石蠟包埋，HE染色，光學顯微鏡觀察記錄。在距離回盲部3cm處取面積為1 mm×1 mm的小腸組織，放入4%戊二醛固定，PBS漂洗，1%鋨酸固定2 h，丙酮梯度脫水，樹脂包埋，半薄切片定位，超薄切片，鈾染，鉛染，透射電鏡觀察。

1.2.8 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，三組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組空腸動力比較 與假手術組比較，缺血再灌注組和高壓氧預處理組的空腸推進長度和空腸推進率明顯降低(P均＜0.01)。與缺血再灌注組相比，高壓氧預處理組的空腸推進長度和空腸推進率明顯改善(P均＜0.01)。見表1。

表1 各組空腸動力比較(n=10，±s)

表1 各組空腸動力比較(n=10，±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.01，與缺血再灌注組比較，#P＜0.01。

組別 空腸長度(cm)空腸推進長度(cm)空腸推進率(%)假手術組8.51±0.356 6.96±0.461 80.60±2.62缺血再灌注組 8.76±0.347 3.16±0.287* 37.90±3.49*高壓氧預處理組 8.58±0.316 5.04±0.384*#59.50±2.50*##

2.2 光鏡及電鏡觀察結果 光鏡下，假手術組小腸黏膜保持完整，腸絨毛形態正常;缺血再灌注組黏膜下水腫、淤血，大量炎性細胞浸潤，腸絨毛破壞，上皮細胞壞死，大量滲出，腸絨毛高度下降，數量減少;高壓氧預處理組黏膜下血管輕微充血，少量炎性細胞浸潤。電鏡下，假手術組可見兩個吸收細胞之間正常的緊密連接、中間連接和橋粒，小腸微絨毛排列整齊;缺血再灌注組微絨毛減少，緊密連接、中間連接部分融合、模糊不清或消失;高壓氧預處理組微絨毛基本正常，細密，排列整齊，可見清晰的緊密連接、中間連接和橋粒。

2.3 各組MPO活性與血清TNF-α水平比較 與假手術組對比，缺血再灌注組和高壓氧預處理組MPO活性、血清 TNF-α水平顯著增高 (P均 ＜0.01);與缺血再灌注組相比，高壓氧預處理組腸組織MPO活性、血清TNF-α水平降低(P均＜0.01)。見表2。

表2 各組腸組織MPO活性和血清TNF-α水平測定(n=10，±s)

表2 各組腸組織MPO活性和血清TNF-α水平測定(n=10，±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.01;與缺血再灌注組比較，#P＜0.01。

組別 MPO(U/g) TNF-α(pg/mL)假手術組0.05±0.006 29±5.461缺血再灌注組 0.18±0.025* 101±18.287*高壓氧預處理組 0.11±0.024*# 55±12.384*#

3 討論

完整的腸道功能包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障，其中以機械屏障最為重要［3］。機械屏障的結構基礎為黏液層、完整的腸黏膜上皮細胞和上皮細胞間的緊密連接［4～7］。當機體遭受嚴重創傷、免疫力下降、便秘、嚴重感染、休克等情況時，可直接或間斷破壞腸道機械屏障。

缺血再灌注損傷是組織器官在缺血的基礎上恢復血流后，其自身損傷反而加重的現象。缺血再灌注損傷是創傷、嚴重感染及休克等疾病共同存在的病理生理過程，可導致許多嚴重并發癥，是外科常見的組織器官損傷之一［8］。小腸是對缺血再灌注損傷最敏感的器官之一，在腹部外傷、失血性休克、腸絞窄、小腸移植和腸系膜血管缺血性疾病等情況下，均會造成小腸的缺血性損傷，在組織恢復血供時，再灌注損傷進一步加重對小腸的損傷，引起腸黏膜機械屏障損害，嚴重者可以導致 SIRS、MODS［9］。本實驗中缺血再灌注組小腸上皮細胞壞死，大量炎性細胞滲出，緊密連接部分融合、模糊不清或消失。表明缺血再灌注損傷能夠破壞大鼠腸道的機械屏障。

高壓氧作為一種輔助治療已經廣泛應用于多種缺血再灌注損傷模型，如心肌、骨骼肌、腦、肝臟、腎臟等，并取得滿意結果。Daniel等發現高壓氧治療能明顯降低腸缺血再灌注后大鼠腸黏膜的凋亡指數。Chen等［10］證實，高壓氧預處理能減少大腦炎性細胞的滲出，減少MDA的生成，增加ATP的產量，明顯減輕大腦的再灌注損傷。Wada等［11］發現，高壓氧預處理能提高熱休克蛋白的表達，從而也揭示了高壓氧預處理能使腦組織對缺氧缺血產生耐受的機制之一。有研究表明，高壓氧預處理可模擬缺血預處理，誘導脊髓缺血耐受，而且高壓氧預處理誘導的脊髓缺血耐受效應可以被氧自由基清除劑二甲基硫脈消除，證實氧自由基在高壓氧預處理機制中具有重要意義。由于自由基與抗氧化酶之間存在著密切關系，高壓氧預處理作為一個預刺激，在其處理期間，可能通過自由基的增多上調神經元抗氧化酶水平，提高神經元的抗氧化能力，從而增加了對隨后氧化損傷的耐受性。本實驗發現，高壓氧預處理組小腸黏膜血管輕微充血，少量炎性細胞浸潤，微絨毛基本正常，細密，排列整齊，可見清晰的緊密連接、中間連接和橋粒。證實高壓氧能夠減輕大鼠腸機械屏障的缺血再灌注損傷。

MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒產生的一種重要的過氧化物酶，主要存在于嗜中性粒細胞和單核細胞中，MPO也是一種血紅素蛋白，可作為中性粒細胞的特異性標記物，反映炎癥損傷的程度。本實驗發現，假手術組腸組織MPO活性較低，缺血再灌注組和高壓氧預處理組顯著增高，表明經受腸缺血再灌注后，大鼠腸組織出現明顯的中性粒細胞浸潤積聚，導致組織髓過氧化物酶水平顯著升高。與缺血再灌注組相比，高壓氧預處理組腸組織MPO活性較低，表明高壓氧預處理能夠顯著改善中性粒細胞的浸潤，減低MPO活性。活化的中性粒細胞除自身釋放各種炎癥介質外，還可刺激單核/巨噬細胞、淋巴細胞、腸上皮細胞及內皮細胞等產生炎癥介質和細胞因子，如 TNF-α、lL-6、IL-1、lL-2、IL-8、PAF 和白細胞三烯等。Zhang等［12］研究顯示，大鼠發生腸缺血再灌注損傷時，門靜脈和外周血清TNF-α水平顯著升高，所以，TNF-α可能是腸缺血再灌注損傷時的關鍵性炎癥介質之一。本實驗發現，與假手術組對比，缺血再灌注組和高壓氧預處理組TNF-α水平顯著增高，表明經受腸缺血再灌注后，血清中炎性細胞因子大量釋放。與缺血再灌注組相比，高壓氧預處理組血清TNF-α活性較低，提示高壓氧預處理能抑制血清中炎性細胞因子釋放，減輕炎癥反應損傷［13］。

總之，高壓氧預處理能減輕大鼠腸缺血再灌注誘導的氧化應激損傷及中性粒細胞積聚，減輕大鼠腸機械屏障的缺血再灌注損傷。高壓氧預處理作為一種干預因素，能激發機體內源性保護機制，從而減輕其后所受到的組織缺血、創傷等因素引起的組織損傷，有重要的臨床應用價值。

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