HME、AS在胃癌組織中的表達及臨床意義

盧 杰，石 海，程 芃，張楠楠，許建明，胡乃中

胃癌是目前世界上最常見的致死原因［1－2］，由于目前胃癌發病機制尚未完全闡明，早期無特異性的癥狀和體征，所以患者的就診率低，早期胃癌檢出率低，死亡率高。故胃癌早期診斷和預后判定是胃癌研究急需解決的問題。人巨噬細胞金屬彈力酶(human macrophage metalloelastase，HME)是胃癌細胞穿透基底膜和腫瘤浸潤組織必不可少的一種活性物質，部分腫瘤細胞也具有分泌巨噬細胞金屬彈力酶的作用，HME能分解纖溶酶原生成血管抑素(gngiostatin，AS)，其能抑制腫瘤的微血管內皮細胞增殖，對早期胃癌診斷及預后評估有重要意義。該研究對HME和AS在胃癌組織中的表達進行探討，并分析兩者在胃癌組織中表達的關聯性及其意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2007年6月～2008年1月安徽醫科大學第一附屬醫院病理確診的30例胃癌患者病理蠟塊標本和癌旁正常胃黏膜;胃癌組織和癌旁組織均再次由病理科醫師經HE染色鏡檢確認診斷結果。患者術前均未接受放化療，術后均經病理證實，同時患者未合并其他惡性腫瘤。30例癌旁正常胃黏膜組織均取自距胃癌組織切緣5 cm以外的正常胃黏膜組織。所有病例臨床及病理資料完整，見表1。

1.2 主要試劑 兔抗人Anti－Angiomotin多克隆抗體購自美國 Abcam公司;基質金屬蛋白酶－12(MMP－12)兔抗人多克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色液、檸檬酸鹽及PBS均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化SP法對石蠟切片進行染色，石蠟包埋組織切片(厚為3 μm)經常規脫蠟、水化;按要求進行抗原修復后，滴加羊血清封閉抗原，滴加一抗、生物素標記的二抗及鏈霉素親和素－過氧化物酶，DAB顯色，常規梯度酒精脫水、封片、拍照;所用HME抗體的濃度為1∶50;所用AS抗體的濃度為1∶100。

1.4 結果判定 HME染色陽性位于細胞質和(或)細胞膜中呈棕黃色，顯色較強時呈棕褐色。AS染色陽性位于胞質中呈棕黃色，顯色強時呈棕褐色，光鏡下用高倍鏡視野對每例胃癌組織及癌旁組織切片區域連續計數500個細胞，計算胃癌細胞所占的陽性比例，其中無細胞被染色的為陰性(－)，細胞染色陽性占比例＜10%為(+)，細胞染色陽性比例占10% ～50%為)，細胞染色陽性＞50%為()。為便于統計描述，對標本進行分類，0～+為弱染，定為陰性表達;()～()為強染，定為陽性表達。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行分析。計數資料分布采用χ2檢驗分析進行比較，HME和AS表達的關聯性采用2×2列聯分析進行比較。

2 結果

2.1 胃癌和癌旁組織中HME、AS的表達 胃癌組織和癌旁組織各30例。HME在正常的胃黏膜組織中大多部分表達為陰性，少部分表達為陽性;在胃癌組織中表達主要分布在細胞質和(或)細胞膜中，染色后呈棕黃色。在癌旁組織中HME陽性率為10.0%(3/30)，胃癌組織中陽性率為 66.7%(20/30);明顯高于在癌旁中的表達(χ2=20.376，P ＜0.05)，見表1、圖1。AS在正常胃黏膜中少部分表達為陽性，多部分表達為陰性;在胃癌組織中的表達主要位于胞質中，其染色陽性表達呈棕黃色顆粒。在癌旁組織中AS陽性率為16.7%(5/30);胃癌組織中陽性率為73.3%(22/30);顯著高于在癌旁中的表達(χ2=19.461，P ＜0.05)，見表1、圖1。

2.2 HME和AS在胃癌組織中表達的關聯性分析

在30例胃癌組織HME和AS的聯合檢測中發現同時為陽性的為63.3%(19/30)，同時為陰性的為23.3%(7/30);在HME表達陽性的例數中AS同時表達為陽性率95%(19/20)，在AS表達陽性的例數中HME同時表達為陽性的為86.4%(19/22);HME和AS在胃癌組織中表達存在關聯 (r=0.570，P＜0.05)，見表2。

2.3 HME和AS在胃癌中的表達與胃癌臨床病理參數的關系 HME的陽性表達與胃癌的分化程度、血管浸潤有關(P＜0.05)，與其他臨床病理參數無顯著相關性;AS的陽性表達與腫瘤大小、浸潤程度、血管浸潤、淋巴及遠處轉移有關(P＜0.05)，與其他臨床病理參數無顯著相關性，見表1。

表1 胃癌組織中HME和AS的表達與臨床病理參數的關系

表2 HME和AS在30例胃癌組織中的表達情況

3 討論

惡性腫瘤的發生和致死主要是因為其能侵襲正常組織并向遠處轉移，降解破壞細胞外基質是腫瘤侵襲和轉移的必要條件，大部分細胞外基質的破壞是由基質彈性金屬蛋白酶完成的。基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases family，MMPs)是一種細胞外基質膚鏈內切酶，其催化活性依賴于酶活性中心與金屬鋅離子的結合［3］;MMPs最初都是以細胞分泌無活性的酶前體形式存在，只有當被激活時才發揮其作用，能影響機體多種生理和病理過程，如癌癥、創傷愈合、胚胎發育、組織形成、炎性疾病等疾病［4］。研究［5］表明，很多惡性腫瘤存在 MMPs高表達，MMPs通過降解細胞外基質從而促進腫瘤的侵襲和轉移［6－8］。

HME由活化的巨噬細胞分泌，是MMPs中的一員，又稱為MMP－12，能降解多種細胞外和非細胞外成分，彈性蛋白是其主要底物。一方面HME可以通過分解纖溶酶原和Ⅲ型、V型、X型膠原而產生血管抑素，抑制腫瘤血管生成、腫瘤的侵襲及生長;另一方面其還能分解細胞外基質，如Ⅳ型膠原和纖維蛋白，以促進血管生成，促進腫瘤侵襲和轉移［9］。研究［10］顯示，與其他MMP家族成員具有促進腫瘤浸潤轉移的作用不同，HME具有獨特的抗腫瘤生長及轉移的作用。AS并不是直接由腫瘤細胞分泌，而是腫瘤細胞可以產生或激活某種蛋白酶，這種蛋白酶可將體內的前體分解為血管生成抑制劑［11］。國外研究［12－14］顯示，HME 可分解纖溶酶原，從而促進AS生成，抑制腫瘤血管內皮細胞的增殖，促進腫瘤血管內皮細胞凋亡，抑制腫瘤浸潤。HME在AS生成的過程中直接作為關鍵分子發揮作用，使得HME與腫瘤的關系備受關注。

前期的研究［15］顯示，人胃癌細胞能表達HME，并因此減少腫瘤微血管的形成;同時表明HME高表達與抑制胃癌的血管浸潤及術后復發顯著相關，并可能減少淋巴管浸潤和淋巴結轉移，提高患者術后生存率;HME的高表達可以降低腫瘤組織的血管密度，并與較好的預后有密切相關，對抑制腫瘤新生血管形成、抑制胃癌的進一步發展及術后復發起著至關重要的作用，基于以上研究結果，設想HME抑制胃癌生長可能與其影響腫瘤血管生成機制有關，本研究將在以往的工作基礎上進一步探討HME抑制胃癌生長作用機制。本實驗顯示HME在胃癌組織中表達明顯高于正常的胃黏膜組織，差異有統計學意義，說明HME蛋白過表達與胃癌發生、發展、轉移及預后有著密切的聯系，HME的陽性表達與胃癌的分化程度、血管浸潤有關，胃癌分化程度越高，HME表達的越高;有血管浸潤組織的HME表達明顯低于無血管潤的組織，與其他臨床病理參數無顯著相關性;AS在胃癌組織中表達明顯高于正常的胃黏膜組織，差異有統計學意義，說明AS蛋白過表達也與胃癌的發生有著密切的聯系，AS的陽性表達與腫瘤的大小、浸潤程度、血管浸潤、淋巴及遠處轉移有關，在腫瘤較大的組織中AS的表達低于腫瘤較小的組織，在腫瘤浸潤程度較深，或者有血管浸潤，淋巴及遠處轉移的組織中陽性表達低于腫瘤浸潤程度淺，無血管浸潤，淋巴及遠處轉移的組織，與其他臨床病理參數無顯著相關性。通過對HME和AS在胃癌中表達的列聯分析表明HME和AS在胃癌組織表達存在相關性，說明HME表達抑制胃癌生長的機制可能是通過分解纖溶酶原生成AS所致，也為探討HME如何抑制腫瘤細胞生長的機制提供了線索。以及進一步研究胃癌生長作用及其作用途徑，探討胃癌的發生、發展及預后機理、開發判斷胃癌的早期診斷，分子靶向治療及預后等方面均具有重要意義。

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