長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

朱棟良，尹小平，王芳元

(咸寧市中心醫(yī)院，同濟(jì)咸寧醫(yī)院肝膽胰胃腸外科，湖北 咸寧 437100)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

朱棟良，尹小平，王芳元△

(咸寧市中心醫(yī)院，同濟(jì)咸寧醫(yī)院肝膽胰胃腸外科，湖北 咸寧 437100)

目的:檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，并觀察過(guò)表達(dá)MEG3對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。方法:檢測(cè)人正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460及結(jié)直腸癌細(xì)胞SW48、LoVo中MEG3的水平，在SW48細(xì)胞和LoVo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，利用Transwell小室及劃痕實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)MEG3對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，通過(guò)Western blotting檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果:結(jié)直腸癌細(xì)胞SW48和LoVo中MEG3的水平明顯低于人正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460;在SW48和LoVo細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MEG3后能夠明顯抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力;Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)顯示MEG3表達(dá)組SW48細(xì)胞的穿膜數(shù)及LoVo細(xì)胞的穿膜數(shù)與對(duì)照組比較明顯減少。劃痕實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)MEG3后細(xì)胞間距較對(duì)照組明顯增大，提示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱。同時(shí)過(guò)表達(dá)MEG3可明顯降低細(xì)胞中MMP－2及MMP－9的表達(dá)，增高金屬蛋白酶組織抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase－2，TIMP－2)的表達(dá)。結(jié)論:結(jié)直腸癌細(xì)胞中MEG3水平較正常結(jié)直腸細(xì)胞明顯降低;在結(jié)直腸癌中過(guò)表達(dá)MEG3可抑制細(xì)胞的侵襲、遷移運(yùn)動(dòng)能力，并且可能通過(guò)影響TIMP－2、MMP－2及MMP－9的表達(dá)發(fā)揮上述功能。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA;母系表達(dá)基因3;結(jié)直腸腫瘤;腫瘤侵襲;細(xì)胞遷移;基質(zhì)金屬蛋白酶

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non－coding RNA，lncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于人類基因組中，根據(jù)目前的人類全基因組測(cè)序的結(jié)果推斷，大概有20～40萬(wàn)種不同的lncRNA，數(shù)量約為編碼基因的10～20倍。lncRNA可通過(guò)不同方式影響編碼基因的表達(dá)量和功能，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程起調(diào)控作用［1－2］。母系表達(dá)基因3 (maternally expressed gene 3，MEG3)是目前發(fā)現(xiàn)lncRNA中的一個(gè)，其主要表達(dá)于正常大腦、骨髓、乳腺、子宮、肺及胃腸道組織中，而在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯減低乃至缺失［3－5］。既往文獻(xiàn)報(bào)道MEG3的表達(dá)抑制可能在胃癌的增殖中發(fā)揮重要的作用［6］，但MEG3在結(jié)腸癌中有何作用尚不明確。本研究擬利用人正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460及人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW48、LoVo觀察MEG3對(duì)于結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響，并初步探索其中可能的機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞及試劑

人正常結(jié)腸細(xì)胞系NCM460及人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW48、LoVo購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);抗MMP－2抗體、抗MMP－9抗體、抗TIMP－2抗體及抗GAPDH抗體(Cell Signalling);Transwell(8 μm孔徑)及Matrigel等均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司;PCR引物由廣州銳博生物有限公司設(shè)計(jì)并合成，其中MEG3的上游引物為5’－GGAGCTGTTGAGCCTTCAGT－3’，下游引物為5’－ATTGAGAGCACAGTGGGGTG－3’;U6的上游引物為5’－GACAGACCCTCACTACTG－3’，下游引物為5’－GATAGTACATGACAAGCTGC－3’;MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由武漢擎科生物有限公司設(shè)計(jì)并合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)NCM460、SW48及LoVo 3種細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2溫箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real－time PCR)檢測(cè)NCM460、SW48及LoVo中MEG3的表達(dá)收集1× 106細(xì)胞，通過(guò)Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用上述引物行PCR擴(kuò)增，ABI 7300檢測(cè)并分析各細(xì)胞中MEG3的水平。

2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體對(duì)SW48細(xì)胞及LoVo細(xì)胞常規(guī)轉(zhuǎn)染MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，使其中的MEG3高表達(dá)，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，重懸于無(wú)血清RPMI－1640培養(yǎng)液，以每孔5×104加入到預(yù)鋪好Matrigel的Transwell小室上室內(nèi)，下室加入500 mL完全培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后多聚甲醛固定，0.01%結(jié)晶紫染色，200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨即取5個(gè)視野，取平均值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)利用上述轉(zhuǎn)染后收集的各組細(xì)胞，重懸于無(wú)血清RPMI－1640培養(yǎng)液，以每孔5×104加入到Transwell小室上室內(nèi)，下室加入500 mL完全培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后多聚甲醛固定，0.01%結(jié)晶紫染色，200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨即取5個(gè)視野，取平均值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.5細(xì)胞劃痕運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)將SW48細(xì)胞及LoVo細(xì)胞按照每孔5×105接種于6孔板中，按照上述實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞融合度達(dá)到95%以上，用無(wú)菌Tip頭部劃線，置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后光學(xué)顯微鏡下拍照，隨即取5個(gè)視野，測(cè)量劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距取平均值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 免疫印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)收集上述轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，裂解獲取細(xì)胞總蛋白，各樣品通過(guò)BCA法檢測(cè)蛋白濃度，各蛋白樣品按照上述檢測(cè)所得濃度分別取50 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后依次孵育I抗及II抗最后用ECL顯色液顯影檢測(cè)細(xì)胞中MMP－2、MMP－9及TIMP－2的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照，結(jié)果通過(guò)ImageJ進(jìn)行灰度值分析并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 MEG3在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)明顯減少

通過(guò)real－time PCR檢測(cè)NCM460、SW48及LoVo細(xì)胞中MEG3的表達(dá)，利用U6作為內(nèi)參照，結(jié)果提示相對(duì)于正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW48細(xì)胞及LoVo細(xì)胞中MEG3的水平明顯降低，而通過(guò)外源性轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒可以明顯恢復(fù)細(xì)胞中MEG3的水平，見圖1。

2 過(guò)表達(dá)MEG3抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲

按上述分組將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于預(yù)鋪Matri gel的Transwell小室中檢測(cè)其侵襲能力。結(jié)果提示高表達(dá)MEG3的SW48細(xì)胞其穿膜細(xì)胞數(shù)為(33± 7)個(gè)/視野，相比對(duì)照組［(228±11)個(gè)/視野)］顯著減少(P＜0.05);高表達(dá)MEG3的LoVo細(xì)胞其穿膜細(xì)胞數(shù)為(28±5)個(gè)/視野，相比對(duì)照組［(198± 17)/視野)］顯著減少(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.The expression of MEG3 was detected in colorectal cancer cells，and MEG3 was over－expressed by plasmid transfection.A: the expression of MEG3 in NCM460，SW48 and LoVo cells;B，C:MEG3 was over－expressed by plasmid transfection in SW48 and LoVo cells，respectively.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCM460 or control.圖1 檢測(cè)MEG3在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平并通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過(guò)表達(dá)MEG3

Figure 2.Over－expression of MEG3 inhibited the invasion of colorectal cancer cells observed by Transwell assay with Matrigel(×400).圖2 過(guò)表達(dá)MEG3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力

3 過(guò)表達(dá)MEG3抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移

按上述分組將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞直接接種于Transwell小室中檢測(cè)其遷移能力，結(jié)果提示，高表達(dá)MEG3的SW48細(xì)胞其穿膜細(xì)胞數(shù)為(46±6)個(gè)/視野，相比于對(duì)照組［(341±16)個(gè)/視野］顯著減少(P＜0.05);高表達(dá)MEG3的LoVo細(xì)胞其穿膜細(xì)胞數(shù)為(39±3)個(gè)/視野，相比對(duì)照組［(263±10)個(gè)/視野)］顯著減少(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Over－expression of MEG3 inhibited the migration of colorectal cancer cells observed by Transwell assay (×400).圖3 過(guò)表達(dá)MEG3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力

4 過(guò)表達(dá)MEG3抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

將SW48細(xì)胞及LoVo細(xì)胞分別接種于6孔板，轉(zhuǎn)染MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后行細(xì)胞劃痕，24 h后普通光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果提示，SW48細(xì)胞及LoVo細(xì)胞高表達(dá)MEG3后，與對(duì)照相比，劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距明顯增大，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力減弱，見圖4。

5 過(guò)表達(dá)MEG3抑制基質(zhì)金屬蛋白酶家族相關(guān)蛋白的表達(dá)

將上述細(xì)胞裂解提取總蛋白后行Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)MEG3后MMP－2和MMP－9的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而TIMP－2的表達(dá)增高(P＜0.05)，見圖5。

Figure 4.Over－expression of MEG3 inhibited the mobility of colorectal cancer cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖4 過(guò)表達(dá)MEG3抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力

Figure 5.The effect of MEG3 on the expression of MMP family proteins in colorectal cancer cells detected by Western blotting.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖5 過(guò)表達(dá)MEG3對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白表達(dá)的影響

討論

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人們發(fā)現(xiàn)基因組中除了大約20 000個(gè)蛋白編碼基因，還同時(shí)含有大量的非編碼RNAs(non－coding RNAs，ncRNAs)。ncRNAs本身雖不能編碼蛋白質(zhì)，但能通過(guò)多種方式調(diào)控編碼基因的表達(dá)和功能，近數(shù)10年來(lái)針對(duì)ncRNAs的研究多集中在microRNAs上，并取得了諸多研究成果［7－10］，但對(duì)于序列長(zhǎng)度超過(guò)200核苷酸的lncRNAs的研究尚剛剛起步。lncRNAs的序列長(zhǎng)度長(zhǎng)于microRNAs，其調(diào)控基因表達(dá)和功能的方式也與microRNAs迥異，不僅可以影響蛋白翻譯發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，還可通過(guò)影響基因的轉(zhuǎn)錄活性及蛋白降解等多種途徑發(fā)揮功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，MEG3作為一種印跡基因編碼的lncRNA，在胚胎發(fā)育及多種正常細(xì)胞中均有明顯表達(dá)，但在垂體瘤、肝細(xì)胞癌、卵巢癌等多種腫瘤中表達(dá)明顯降低或缺失，而且MEG3的表達(dá)降低與胃癌的臨床預(yù)后不佳相關(guān)，MEG3還可以通過(guò)調(diào)控P53的表達(dá)影響非小細(xì)胞肺癌的增殖和凋亡［3－6］。但MEG3在結(jié)直腸癌細(xì)胞的表達(dá)及功能尚不十分明確。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，MEG3在結(jié)直腸癌細(xì)胞的表達(dá)明顯低于正常結(jié)腸細(xì)胞，提示MEG3的表達(dá)抑制可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生。結(jié)直腸癌細(xì)胞最重要的惡性行為即具有高度的侵襲轉(zhuǎn)移能力，所以我們進(jìn)一步在結(jié)直腸癌細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)染MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒恢復(fù)其表達(dá)，觀察過(guò)表達(dá)MEG3對(duì)于細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。而Transwell侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)過(guò)表達(dá)MEG3可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力，提示MEG3不僅參與結(jié)直腸癌的發(fā)生，更有可能與結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移相關(guān)。為了明確MEG3通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力，我們通過(guò)Western blotting檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶家族相關(guān)基因的表達(dá)。基質(zhì)金屬蛋白酶是目前公認(rèn)的調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，不同類型的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增高或者活性升高，抑或TIMP－2等基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物的下調(diào)都能促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MEG3可以顯著抑制MMP－2及MMP－9的表達(dá)，而上調(diào)TIMP－2的表達(dá)，從而為MEG3調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移提供了可能的理論依據(jù)。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中MEG3的表達(dá)明顯降低，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MEG3可抑制細(xì)胞的侵襲、遷移及運(yùn)動(dòng)能力。同時(shí)過(guò)表達(dá)MEG3后基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白明顯變化，提示MEG3可能通過(guò)其調(diào)控結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。本文提示MEG3在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供了新的藥物靶點(diǎn)及監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

［1］Flintoft L.Non－coding RNA:structure and function for lncRNAs［J］.Nat Rev Genet，2013，14(9):598.

［2］于志奇，張暢勞，昕元，等.長(zhǎng)鏈非編碼RNA調(diào)節(jié)細(xì)胞周期素D1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞輻射敏感性的影響［J］.中華胃腸外科雜志，2012，15(3):288－291.

［3］He Y，Meng XM，Huang C，et al.Long noncoding RNAs:Novel insights into hepatocelluar carcinoma［J］.Cancer Lett，2014，344(1):20－27.

［4］Lu KH，Li W，Liu XH，et al.Long non－coding RNA MEG3 inhibits NSCLC cells proliferation and induces apoptosis by affecting p53 expression［J］.BMC Cancer，2013，13:461.

［5］Qin R，Chen Z，Ding Y，et al.Long non－coding RNA MEG3 inhibits the proliferation of cervical carcinoma cells through the induction of cell cycle arrest and apoptosis［J］.Neoplasma，2013，60(5):486－492.

［6］Sun M，Xia R，Jin F，et al.Downregulated long noncoding RNA MEG3 is associated with poor prognosis and promotes cell proliferation in gastric cancer［J］.Tumour Biol，2014，35(2):1065－1073.

［7］徐學(xué)虎，吳小兵，伍尚標(biāo)，等.miR－490－5p和miR－363作為結(jié)直腸癌診斷標(biāo)記的研究［J］.中華胃腸外科雜志，2014，17(1):45－50.

［8］李珊，李艷艷，高靜，等.miR－34a表達(dá)水平與結(jié)直腸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.中華胃腸外科雜志，2013，16(1):60－65.

［9］張思毅，盧仲明，宋新漢，等.喉癌組織中的microRNA差異表達(dá)譜及miR－125a－5p抑制喉癌細(xì)胞增殖的初步研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29(1):86－92.

［10］藺新秀，楊蔓，夏天，等.競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA與腫瘤發(fā)生［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30(3):563－566.

Effect of long non-coding RNA MEG3 on invasion and migration of colorectal cancer cells

ZHU Dong－liang，YIN Xiao－ping，WANG Fang－yuan

(Department of General Surgery，Xianning Central Hospital，Tongji Xianning Hospital，Xianning 437100，China.E-mail: xnzxyywfy@126.com)

AIM:To investigate the expression of long non－coding RNA maternally expressed gene 3(MEG3) in colorectal cancer(CRC)cells，and to observe the effect of MEG3 on the invasion and migration of CRC cells.METHODS:The levels of MEG3 in human normal colon cell NCM460 and CRC cells SW48 and LoVo were detected by real－time PCR.MEG3 was over－expressed by plasmid transfection，and the effects of MEG3 on the invasion and migration of SW48 and LoVo cells were analyzed by Transwell assay and wound healing assay.The expression of matrix metalloproteinase (MMP)family proteins was determined by Western blotting.RESULTS:The level of MEG3 was down－regulated in CRC cells compared with normal colon cell NCM460.The invasion and migration of CRC cells were reduced after MEG3 over－expression.Transwell invasion and migration assays showed that the numbers of transmembrane SW48 and LoVo cells were smaller in MEG3 over－expression group than control group(P＜0.05).The cell spaces were broader after MEG3 over－expression in the wound healing assay，indicating that MEG3 over－expression inhibited the mobility of CRC cells.Meanwhile，over－expression of MEG3 reduced the expression of MMP－2 and MMP－9，and elevated the expression of tissue inhibitor of metalloproteinase－2(TIMP－2).CONCLUSION:The expression of MEG3 is down－regulated in CRC cells.Over－expression of MEG3 inhibits the invasion and migration of CRC cells.TIMP－2，MMP－2 and MMP－9 might play an important role in this regulation.

Long non－coding RNA;Maternally expressed gene 3;Colorectal neoplasms;Neoplasm invasiveness;Cell migration;Matrix metalloproteinase

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.019

1000－4718(2015)02－296－05

2014－09－17

2014－11－24

△通訊作者Tel:0715－8896278;E－mail:xnzxyywfy@126.com