以TF為靶點的裸DNA疫苗脾內轉染對結直腸癌的免疫抑制作用*

鄧麗，陳誠，胡丹，曾廣正，馬景勝，饒本強

(南昌大學第三附屬醫院胃腸病學研究所，江西 南昌 330006)

以TF為靶點的裸DNA疫苗脾內轉染對結直腸癌的免疫抑制作用*

鄧麗，陳誠，胡丹，曾廣正，馬景勝，饒本強△

(南昌大學第三附屬醫院胃腸病學研究所，江西 南昌 330006)

目的:探討以組織因子(tissue factor，TF)為靶點的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內單次注射對結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的免疫抑制作用。方法:采用分子生物學技術構建攜帶TF靶向肽SPTT和免疫球蛋白H鏈基因的裸DNA質粒pγ1.Ig H.SPTT，質粒脾內單次注射后，檢測外周血轉基因產物SPTT－Ig H濃度，分析質粒脾內轉染效率、特性及其對CRC的作用。結果:重組pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內單次注射后第4周脾組織即有SPTT－Ig H融合基因強表達，12周強度開始下降，至16周消失;轉染質粒后第2周外周血SPTT－Ig H濃度為7.2 μg/L，后逐漸升高，第8周達高峰為13.11 μg/L;質粒脾內注射后轉錄基因定向在脾組織表達，淋巴結、骨髓、肝、腎、等組織未發現目的基因轉染;pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內轉染對結直腸癌具有抑制作用(P＜0.01)。結論:以TF為靶點的裸DNA疫苗pγ1.Ig H.SPTT單次脾內注射可以激發機體對結直腸癌的保護性免疫反應，是治療CRC的一種安全有效的免疫方法。本課題研究為裸DNA疫苗抗腫瘤免疫治療提供了新的思路。

組織因子;裸DNA疫苗;結直腸癌

體細胞轉基因免疫接種(somatic transgene immunization，STI)將含外源蛋白基因質粒DNA直接導入體細胞，可誘發機體保護性免疫反應［1］。STI激發的免疫反應可以抑制病毒復制、殺滅細菌和寄生蟲，甚至抑制腫瘤生長，部分研究成果已批準進入臨床實驗［2－3］。初步結果顯示裸DNA質粒作為一種轉基因疫苗對腫瘤和感染性疾病的預防和治療具有潛在應用前景。STI作用依賴于DNA在體細胞內的轉染效率、轉錄產物的分泌及轉錄產物所產生的生物學效應。然而，目前多數研究僅僅集中于外源DNA轉錄后最終所產生的生物學效應，對基因轉染的載體細胞、轉染產物的表達效率和提呈、轉染基因的歸宿等了解甚少，STI作為一種新型免疫治療方法尚未獲得滿意的療效［4－5］。

B淋巴細胞產生于骨髓，并終生定位于次級淋巴器官和血液中。在受到抗原激活后，一個B淋巴細胞激活后每秒能產生1×103～8×104個免疫球蛋白分子，每個B淋巴細胞均是一個抗體生產微型工廠［6］;B淋巴細胞除分泌抗體外，還通過其膜表面Lg受體將其分泌的、含有它們自身Ig結構的蛋白多肽提呈給T細胞，誘導細胞免疫［7］。因此，含有豐富B淋巴細胞的脾臟是裸DNA質粒接種的理想器官［1］。

具有凝血和信號傳導功能的組織因子(tissue factor，TF)是腫瘤細胞干性標志物［8］。最近，我們利用改良噬菌體展示技術篩選出了TF的小分子高親和短肽SPTT［9］，以此為靶向片段耦合免疫球蛋白效應片段構建了一種抗腫瘤免疫復合物——Benc［10－12］，Benc既能殺傷結直腸癌(colorectal cancer，CRC)細胞、抑制CRC新生血管形成，并毀損CRC成熟血管，對CRC有較好的抑制作用。本研究以SPTT為基本元件，采用分子生物學技術構建攜帶SPTT和免疫球蛋白效應片段的裸DNA質粒，觀察該質粒STI脾內單次轉染在脾B淋巴細胞內的轉染效率、轉錄基因的表達情況及其產物對CRC所產生的保護性免疫反應，探索一種新型、有效的抗腫瘤STI治療方法及其機制。

材料和方法

1 細胞系

人結腸腺癌細胞株HT－29(ATCC，TF表達陽性)用含10%胎牛血清(HyClone)的RPMI－1640(Invitrogen)培養，置于含5%CO2的培養箱37℃培養。CHO細胞(ATCC，質粒轉染細胞)用EXCell/F12無血清培養。

2 實驗方法

2.1 質粒構建和測序鑒定TF靶向小分子片段為本實驗室采用改良噬菌體展示技術篩選、含7個堿基的小分子片段，已證實具有對TF高度靶向性和親和力，委托上海生工公司合成。真核表達質粒γ1NANP含有人巨細胞病毒(human cytomegalovirus)高效啟動子和增強子序列，并攜帶鼠免疫球蛋白V區和人免疫球蛋白γ1C區嵌合基因的H鏈序列，由美國加利福尼亞大學癌癥中心Zanetti教授惠贈。質粒pSVNeo為γ1NANP的對照質粒，與γ1NANP相比，pSVneo不含免疫球蛋白V區和γ1C區基因，購自Invitrogen。

質粒pγ1.Ig H.SPTT由γ1NANP質粒改造而成，即質粒的H鏈V區CDR3環內用2個重復SPTT片段CAT－GCT－TGT－GCT－GCG－CAG－TTT替換3個重復的AGU－GCG－AGU－CCG片段。插入酶切位點為HindⅢ和BamH I酶切位點。Taq DNA聚合酶、T4連接酶和主要限制性內切酶均為TaKaRa產品，見圖1。

pγ1.Ig H.SPTT質粒用DH5a按程序擴增，采用無內毒素質粒提取試劑盒(QIAGEN endo－free GIGA Kit)制備、純化，按下列公式計算DNA純度:DNA純度(%)=(11.1R－6.32)/(2.16－R)，R=A260/ A280。重組質粒pγ1.Ig H.SPTT、γ1NANP和pSVneo委托Invitrogen公司測序鑒定。

Figure 1.A schematic diagram of pγ1.Ig H.SPTT plasmid used to express human immunoglobulin H chain(including the Fc fragment).A small nuclear gene fragment which targeted TF was implanted in CDR3ring as a tumor specific target fragment.Neor:neomycin resistance gene;Ampr:ampicillin resistance gene;IL－2: immune－enhancing gene;PR:promoter;EN:enhancer;CH:heavy chain constant region;VH:heavy chain variable region;FR:skeleton area.圖1 pγ1.Ig H.SPTT質粒示意圖

2.2pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射20只8～10周齡雌性C57BL/6小鼠先行腹腔注射戊巴比妥(75 mg/kg)麻醉后，于左腹位消毒皮膚、剔毛。自左肋下3～4 mm開一小切口，依次剖開腹部皮膚、肌肉和腹膜，暴露腸系膜，鉗夾腸系膜根部將整個脾臟牽拉出腹腔外。沿脾臟長軸方向用微量注射器緩慢注入100 μg質粒DNA生理鹽水溶液(100 μg∶30 μL)，注射時盡量避免局部滲漏、出血，可見脾臟注射局部區域變白。注射完畢后將脾臟放回腹腔，仔細縫合腹膜、皮膚。手術完畢，小鼠置于37℃溫箱保暖促蘇醒，SPF條件下飼養。

2.3 pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射后轉基因產物的ELISA檢測pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射后不同時點(0、2、4、8、12、14周)，用間接ELISA法檢測外周血轉基因產物SPTT－Ig H:包被抗原采用羊抗人γ球蛋白抗體(10 mg/L)，購自Sigma;II抗為HRP標記的羊抗人γ球蛋白抗體，用TMB ELISA試劑顯色(Pierce)。

2.4 PCR和Southern雜交提取pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射后不同時點(0、4、12、16、24、36周)的脾組織DNA，取10 mg脾組織，蛋白酶消化，消化產物置入QIAamp離心柱(Qiagen)，10 000 r/min離心10 min，淘洗2次，雙蒸水稀釋DNA，1%瓊脂糖電泳定量分析。PCR擴增設計4對引物(pCL/pCD、pSE/pNAD、pNEL/pNED、pbA1/pbA2):pCL(2 107～285 bp:5’－TTATTGAGAATAGAGGACATCTG－3’)和pCD(459～439 bp:5’－ATGCTCATAAAACTCCATAAC－3’)為擴增轉錄可變差異性插入區(variable diversity joining，VDJ)引物;pSE(232～211 bp: 5’－AACAGTATTCTTTCTTTGCAGC－3’)和pNAD (352～333 bp:5’－GAGAGTAGGGTACTGGGTTT－3’)為擴增CDR3環中SPTT的引物;pNEL(169～189 bp:5’－AGCACCTACTATCCAGACACT－3’)和pNED (366～346 bp:5’－GTAGTCCATACCATGAGAGTA－3’)為巢式PCR內引物;pbA1(184～201 bp:5’－TGGGCCGCCCTAGTCACC－3’)和pbA2(427～408 bp:5’－CGTTTGGCCTTAGGGTTCAG－3’)是按照序列設計擴增鼠β－actin基因的引物(圖2)。PCR反應體系為0.3 mmol/L引物，0.2 mmol/L脫氧核苷酸，1.5 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，1 U Taq DNA多聚酶。PCR反應條件:94°C 45 s，58°C 45 s，72°C 45 s，30個循環。對PCR產物做Southern blotting分析，先行1%瓊脂糖凝膠電泳，Hybond尼龍膜(Amersham)轉膜6 h，pNAD寡聚核苷酸雜交，用攜帶［γ－32P］ATP的放射性探針T4核苷酸5’－羥基－激酶作為標記進行Southern雜交分析。

為確定基因轉錄的組織分布，按上述方法從脾臟、淋巴結、骨髓、肝、腎、肺和肌肉等組織中提取DNA，PCR擴增后，進行對VDJ片段Southern雜交分析。

Figure 2.A schematic diagram of PCR primers to detect the gene product after transfection of pγ1.Ig H.SPTT into the spleen.圖2 質粒pγ1.Ig H.SPTT脾內轉染后轉基因產物PCR檢測引物設計

2.5 STI技術脾內單次注射pγ1.Ig H.SPTT質粒對CRC的免疫效應(1)細胞培養:人結腸腺癌細胞株HT－29，RPMI－1640培養基體外培養，生長密度達90%左右時用于實驗。(2)DNA質粒STI脾內注射: 8周齡C57BL/6小鼠20只，按前述方法行脾內免疫接種，pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射組10只，pSV－neo質粒脾內注射組10只，再按下列實驗進行分組。(3)參考Xiong等［1］的方法，免疫接種后30 d，建立結腸腺癌細胞株HT－29→C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型(共10只，5只pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射的小鼠，5只pSVneo質粒脾內注射的小鼠)和肺轉移模型(共10只，5只pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射的小鼠，5只pSVneo質粒脾內注射的小鼠):調整HT－29細胞濃度為1×1010/L，取100 μL皮下注射(皮下移植瘤模型)或尾靜脈注射(肺轉移模型)。觀察小鼠精神、飲食、體重等變化及腫瘤生長情況。皮下移植瘤模型按下述公式繪制腫瘤生長曲線:腫瘤體積=腫瘤寬徑×腫瘤長徑×腫瘤長徑×0.5 mm3。腫瘤長徑大于20 mm時終止實驗，脫頸椎處死小鼠，腫瘤稱重，肺轉移模型計算肺轉移結節計算，腫瘤標本及主要器官行病理檢查。

3 統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0軟件進行統計分析，符合正態分布的資料采用獨立樣品的t檢驗;不符合正態分布的資料采用兩個獨立樣品比較的Wilcoxon秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內轉染

pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內單次注射后，第4周脾組織即有SPTT－Ig H融合基因的強表達，PCR和Southern雜交分析均顯示強陽性，12周SPTT－Ig H表達強度開始下降，16周后SPTT－Ig H表達陰性，證實Ig H－SPTT融合基因按設計要求已成功轉染至脾細胞，并至少能維持3個月，見圖3。

2 間接ELISA對轉基因產物的檢測

pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射后間接ELISA檢測外周血SPTT－Ig H的表達，可見質粒轉染第2周外周血檢測即為陽性，其濃度為7.2 μg/L，第2周后濃度逐漸升高，第8周至高峰，達13.11 μg/L，隨后逐漸下降。pSVneo對照質粒皮內注射外周血一直未能檢測到SPTT－Ig H的存在，見表1。

3 pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射基因轉錄的組織分布

pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射后轉錄基因僅在脾組織有表達，第4周至第12周最明顯，第24周基本消退，與外周血檢測結果一致，淋巴結、骨髓、肝、肺、腎、肌肉、骨髓等組織未發現目的基因的轉染，見圖4。

Figure 3.The results of PCR(A)and Southern hybridization (B)for SPTT－Ig H expression after injection of pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid into the spleen at different time points(0，4，12，16，24 and 36 weeks).According to the structure of plasmid DNA，3 pairs of primers were specifically designed for amplification of differentsegments(pCL/pCD，pSE/pNADand pNEL/pNED)，and［32P］－pNADoligonucleotide probes was used for Southern hybridization.β－actin was used as internal controls.圖3 PCR和Southern雜交檢測pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射后脾組織不同時點轉基因產物SPTT-Ig H的表達情況

4 pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內轉染對結直腸癌的免疫效應

pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內轉染對結直腸癌具有抑制作用。pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射組和pSVneo質粒脾內注射組各5只小鼠，手術和麻醉均成功，免疫接種后30 d開始建立皮下腫瘤移植模型，腫瘤移植成功率100%，腫瘤生長曲線和實驗結束時的腫瘤重量見圖5。實驗結束時，pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射組平均腫瘤體積為(173.24±22.16) mm3，pSVneo質粒脾內注射組為(1 170.76± 106.08)mm3;pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內注射組平均瘤重為(0.32±0.07)g，pSVneo質粒脾內注射組為(1.09±0.46)g。

肺轉移模型10只小鼠均存活至實驗結束，pSV－neo質粒脾內注射組的肺轉移結節為69個，平均13.8個，pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內組為22個，平均4.4個，兩組肺轉移結節相比有顯著差異(P＜0.01)，見表2。

表1 pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射后外周血轉基因產物SPTT-Ig H的檢測Table 1.The content of transgene product SPTT－Ig H in the peripheral blood at different time points after intrasplenic inoculation of plasmid DNA pγ1.Ig H.SPTT in the mice(μg/L.Mean±SD.n=8)

Figure 4.The expression of pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid in different tissues after injection into the spleen.A:the result of PCR;B:the Southern hybridization.圖4 pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射后轉染基因組織分布

Figure 5.The immune effect of pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid intraplenic injection on colorectal cancer.A:tumor growth curve.The red line:tumor growth curve of the pγ1.Ig H.SPTT recombinant plasmid injection group;the blue line:tumor growth curve of the pSVneo plasmid injection group.B:the tumor weight in the end of the experiment.C:the sample of tumors in studies(the upper row is the pγ1.Ig H.SPTT plasmid injection group，and the lower row is the pSVneo plasmid injection group).Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs pSVneo.圖5 pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射對結直腸癌的免疫作用

表2 質粒脾內轉染對結直腸癌肺轉移結節的抑制作用Table 2.Inhibitory effect of metastatic lung tumor formation by intrasplenic inoculation of plasmid DNA pγ1.Ig H.SPTT in the 5 mice

討論

CRC免疫治療的臨床實驗已有陽性結果，2011年1篇涉及到2 031例CRC患者疫苗治療meta分析［13］報道自體瘤苗獲益率為46%，DC疫苗為17%，肽疫苗為13%。與這些疫苗相比，DNA疫苗具有“與自然感染相似、誘導免疫反應較強而持久、能引發聯合免疫及可反復使用”等優點而倍受青睞［10］。DNA免疫不需要任何載體和佐劑，僅通過DNA質粒直接轉導體細胞就可以激發保護性免疫反應，被稱為疫苗的“第3次革命”［14］。至2010年止，有17篇CRC－DNA疫苗(CEA－DNA疫苗、5T4－DNA疫苗等)的Ⅰ期臨床實驗報道，獲益率為22%～41%，顯示DNA免疫對CRC具有應用前景［15］。

STI產生保護性免疫反應的前提條件是外源DNA能有效地轉染至受體細胞。本項研究顯示，裸DNA質粒單次脾內注射即可以在轉染細胞內獲得至少3個月的穩定轉染，而且，轉錄基因具有高度表達能力，外周血外源蛋白濃度高峰時達到13.11 μg/L，說明脾臟是STI治療合適的接種部位。Gerloni等［2］研究結果初步表明，STI治療以脾臟為接種部位，其轉導效率和轉基因蛋白表達水平比肌肉注射高100～1 000倍，單次注射既可獲得持久免疫應答。Xiong等［1］探討了其機理，認為STI脾內注射能獲得有效轉染和高效表達的主要原因是外源質粒能定向轉染至脾臟內豐富的B淋巴細胞之故。外源DNA具有整合入周期活躍的細胞習性，脾B淋巴細胞受外源DNA刺激后有絲分裂活躍，處于周期活躍狀態，外源基因容易選擇性地持續感染B淋巴細胞。在本項研究中也證實，外源質粒脾內轉染具有定向性，pγ1.Ig H.SPTT重組質粒脾內注射后，除脾B淋巴細胞外，脾內其它細胞、其它部位淋巴器官和非淋巴器官細胞均無轉導。定向轉導機制與外源基因與B淋巴細胞具有同源性(均含免疫球蛋白H鏈基因)、脾B淋巴細胞受外源DNA刺激后有絲分裂活躍、轉導質粒中附加了淋巴組織特異性調控成分等有關。Gerloni等［16］還更進一步發現，脾內質粒注射后外源基因是以附加體形式轉導于受體細胞核，未整合到受體細胞染色體，不會導致受體細胞突變。這些研究表明，脾內注射是裸DNA免疫治療安全、有效的接種途徑。

利用基因工程技術將腫瘤特異性抗原的高親和肽段植入抗體超變環(CDR3環)，可賦予轉基因產物對腫瘤作用的靶向性［17］，pγ1.Ig H.SPTT質粒轉染脾B淋巴細胞后，轉錄的表達產物SPTT－Ig H能誘導靶向性的抗腫瘤免疫應答反應。pγ1.Ig H.SPTT質粒轉染后，能在B淋巴細胞水平表達具有天然構象的、攜帶有腫瘤特異性抗原TF靶向片段的免疫球蛋白分子(SPTT－Ig H)，后者通過Fc受體與抗原提呈細胞MHC－Ⅱ分子結合，靶向性地提呈至腫瘤部位，與腫瘤表面膜受體TF結合后激發ADCC效應，產生抗腫瘤免疫集焦效能，達到抗腫瘤免疫治療的目的［18］。而且，MHC－Ⅰ分子將植入肽段表達的靶向肽提呈給B淋巴細胞，使引發的免疫反應具有持久性，產生一種類似抗腫瘤的“免疫記憶”效應。

本項目動物實驗研究結果也初步證實，pγ1.Ig H.SPTT質粒脾內轉染對CRC具有免疫治療作用，雖然不能完全達到消滅腫瘤的目的，但可以明顯抑制CRC的生長，對CRC的肺部轉移也有抑制作用。TF同時表達在CRC血管內皮細胞和腫瘤細胞表面，以TF為靶點的抗腫瘤藥物能同時抑制腫瘤細胞和毀損腫瘤血管，我們曾經以腺病毒為載體構建了一種以TF為靶點的免疫復合物質粒，命名為Benc［12］，Benc攜帶有SPTT和免疫球蛋白效應片段的融合基因，瘤內注射和靜脈注射均能對CRC有較好的治療作用，但不可避免地帶來了腺病毒治療所產生的副作用，如肝腎功能損害等。本項目采用包含上述結構的裸DNA疫苗進行治療，可為抗腫瘤的靶向免疫治療帶來了一種新的思路。

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Immunosuppressive effect of naked DNA vaccine targeting tissue factor by intrasplenic inoculation on colorectal cancer

DENG Li，CHEN Cheng，HU Dan，ZENG Guang－zheng，MA Jing－sheng，RAO Ben－qiang

(Institute of Gastroenterology，Third Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.E-mail:benqiangrao@sina.com.cn)

AIM:To investigate the expression of objective gene and the immunosuppressive effect of naked DNA vaccine pγ1.Ig H.SPTT targeting tissue factor by intrasplenic inoculation on colorectal cancer(CRC).METHODS:A special naked DNA vaccine which carried the SPTT peptides and immunoglobulin H chain gene(named pγ1.Ig H.SPTT DNA plasmid)was constructed by molecular biological techniques.After a single injection of this plasmid into the spleen，the concentrations of transgene product SPTT－Ig H in the peripheral blood at different time points were detected by ELISA，and the plasmid transfection efficiency and characteristics were analysis by PCR and Southern blotting.The immunologic effect of the plasmid on the CRC was observed in the mice.RESULTS:The strongest expression of SPTT－Ig H was observed during the 4th week after a single injection of the plasmid，which began to decline at the 12th week and disappeared at the 16th week.The concentration of SPTT－Ig H in the peripheral blood at the 2nd week after transfection of plasmid was 7.2 μg/L，then increased gradually，and reached a peak of 13.11 μg/L at the 8th week.The plasmid－transcriptional gene was only expressed in the spleen，and was not detected in the lymph nodes，bone marrow，liver，kidney，and other organisms.Transfection of pγ1.Ig H.SPTT into the spleen had inhibitory effects on colorectal cancer as compared with control group.CONCLUSION:Naked DNA vaccine pγ1.Ig H.SPTT stimulates the immune response for protecting the body against colorectal cancer，which is a safe and effective method for CRC immunotherapy.

Tissue factor;Naked DNA vaccine;Colorectal cancer

R735.3+5;R392.32

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.018

1000－4718(2015)02－289－07

2014－08－06

2015－01－15

江西省衛生廳資助課題(No.20132032)

△通訊作者Tel:0791－88864360;E－mail:benqiangrao@sina.com.cn