大鼠肢體缺血-再灌注后腦CBS表達的變化及意義*

王瑜玲，馬華民，王冰，張彥，黃新莉

(河北醫科大學第三醫院1神經內科，2藥劑科，河北 石家莊 050051;3河北醫科大學病理生理教研室，河北 石家莊 050017)

大鼠肢體缺血-再灌注后腦CBS表達的變化及意義*

王瑜玲1，馬華民2，王冰1，張彥1，黃新莉3△

(河北醫科大學第三醫院1神經內科，2藥劑科，河北 石家莊 050051;3河北醫科大學病理生理教研室，河北 石家莊 050017)

目的:觀察肢體缺血－再灌注(IR)后腦組織內胱硫醚β－合酶(CBS)表達的變化及意義。方法:夾閉大鼠腹主動脈下段4 h、開放3～24 h復制肢體IR模型。采用逆轉錄多聚酶鏈反應檢測腦內CBS mRNA表達的變化;Western blotting法檢測腦內CBS蛋白的表達;采用全自動酶標儀測定腦組織中CBS活性和硫化氫含量;采用CBS抑制劑羥胺抑制CBS活性后，光鏡觀察腦組織的病理學變化。結果:肢體IR后腦組織CBS mRNA和蛋白表達水平明顯高于假手術組，再灌12 h表達至峰值(均P＜0.01)，再灌注至24 h與假手術組比較無顯著差異(均P＞0.05)。肢體IR后腦組織中CBS活性及硫化氫濃度的變化與CBS mRNA和蛋白表達的變化一致;與假手術組相比，單純缺血組上述各指標均沒有明顯變化(均P＞0.05);肢體IR后抑制CBS活性，IR組腦組織損傷加重。結論:肢體IR后，腦組織中CBS表達上調，所誘生的CBS對神經元具有保護效應。

腦;四肢;再灌注損傷;胱硫醚β－合酶;硫化氫

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后被發現的另一種具有神經調質作用的新型氣體信號分子［1］，在神經系統多種生理和病理生理過程中發揮著重要作用。有研究發現，內源性H2S在全腦缺血－再灌注(ischemia－reperfusion，IR)的發生、發展過程中呈動態變化，并可能在缺血－再灌注早期發揮作用［2］。

局部器官IR是引發多器官功能衰竭的原因之一，我們曾以肢體IR大鼠為模型證實，外周器官IR可致腦組織損傷［3］。雖已有研究證實，氣體信號分子NO和CO均參與了肢體IR腦損傷的發生、發展過程，但目前其發生機制尚不完全清楚。而與NO和CO在多種生理、病理生理過程中具有極為相似特性的H2S，是否也參與了肢體IR腦損傷的發生、發展過程?其作用如何?基于以上疑問，本研究動態觀察了H2S在肢體IR大鼠腦組織中的變化，并進一步給予大鼠H2S合成酶胱硫醚β－合成酶(cystathionine βsynthase，CBS)抑制劑羥胺(hydroxylamine，HA)，造成腦內源性H2S濃度降低，通過觀察不同新生大鼠腦組織形態學變化，為探索H2S在肢體IR腦損傷中的作用提供依據。

材料和方法

1 材料

Trizol RNA提取試劑為Invitrogen產品;逆轉錄試劑盒、Taq DNA聚合酶及dNTP購自Promega;CBS和β－actin引物由北京賽百盛公司合成;兔抗大鼠CBS和小鼠抗大鼠β－actin多克隆抗體均為Santa Cruz的產品;原位凋亡檢測試劑盒購自華美生物公司;其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 動物模型的復制［4］采用體重為200～250 g的健康SD雄性大鼠(河北省實驗動物中心提供)，25%烏拉坦(1.0 g/kg，ip)麻醉，每隔6 h追加1/3～1/2劑量，維持麻醉。分離氣管進行插管，分離頸外靜脈插管以補液(靜脈點滴生理鹽水1 mL/h)。分離腹主動脈下段，在髂總動脈分出前，用無創血管夾(寧波顯微器械廠)夾閉腹主動脈，使雙下肢完全缺血，4 h后松開血管夾使肢體血流再灌注。應用激光多普勒(Perimed)探測血流以保證肢體的缺血和再灌注。

2.2 實驗分組將56只SD大鼠隨機分為4組: (1)假手術(sham)組，進行同樣的麻醉及手術只是不進行血管夾閉;(2)單純缺血(I)組，夾閉血管使肢體缺血4 h;(3)IR組，使肢體缺血4 h后松開血管夾使肢體血液再灌注，根據再灌注時間又分為再灌注3、6、12及24 h組;(4)HA組，夾閉腹主動脈4 h，去夾再灌注到6 h時，腹腔注射CBS抑制劑HA (12.5 mg/kg)，再灌注到12 h。實驗結束時處死大鼠開顱取腦，分離出雙側腦組織(大腦皮層和海馬)進行下述指標檢測。

2.3 腦組織中總RNA的提取和CBS mRNA的RTPCR腦組織總RNA提取操作按照Trizol試劑說明書進行。瓊脂糖凝膠電泳觀察28 S和18 S條帶，測260 nm/280 nm吸光度值并定量后于－80℃保存。CBS mRNA水平以β－actin為內參照，根據逆轉錄試劑盒步驟逆轉錄合成cDNA第1條鏈。聚合酶鏈反應體系如下:10×PCR緩沖液5 μL，MgCl2(25 mmol /L)3 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，上游引物(50 pmol/L)1 μL，下游引物(50 pmol/L)1 μL，模板DNA 1 μg，DNA聚合酶(5×106U/L)0.5 μL，滅菌雙蒸水補至50 μL。反應條件:94℃2 min;隨后以94℃1 min，50℃1 min，72℃1 min，循環30次;最后72℃5 min。CBS引物序列上游為5’－GAA CCA GAC GGA GCA AAC AG－3’，下游為5’－TGT AGA GGA CTT TGC AGA CT－3’，擴增片段大小為572 bp;β－actin引物序列上游為5’－ATG GAT GAC GAT ATC GCT GCG－3’，下游為5’－TCG TCC CAG TTG GTG ACA ATG－3’，擴增片段大小為227 bp。每份樣品的PCR均重復4次。以滅菌雙蒸水代替cDNA作為陰性對照。PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠染色后，凝膠成像照相。用Bandscan 5.0凝膠圖像處理軟件進行灰度分析，以CBS與β－actin的擴增產物條帶灰度值之比作為反映CBS的mRNA相對表達量。

2.4 Western blotting實驗腦組織稱重，加入組織裂解液(10%W/V)(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1%Triton X－100、0.5%脫氧膽酸鈉、1 mmol/L PMSF、0.1%SDS、10 mmol/L NaF、1 mmol/L釩酸鈉、40 mg/L蛋白酶抑制劑混合物)于4℃下勻漿，4℃、12 000×g離心10 min，吸取上清，以考馬斯亮藍G250法進行蛋白定量后將制備好的蛋白樣品置－80℃冰箱保存備用。各組取50 μg樣品蛋白行12%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(100 V，3 h)后轉入硝酸纖維素膜。應用3%脫脂奶粉室溫封閉硝酸纖維素膜1 h，分別加入CBS與β－actin的I抗溶于0.5%抗體稀釋液中(1∶1 000)，4℃密封過夜。TPBS振蕩洗膜后，應用辣根過氧化物酶標記的II抗及DAB顯色試劑盒進行檢測，以出現棕黃色條帶為陽性結果。用GDS凝膠圖像處理系統分別分析CBS蛋白條帶的IA值和β－actin蛋白的IA值，以CBS與β－actin蛋白的IA比值代表CBS蛋白的相對表達量。2.5腦組織中CBS活性測定參照文獻［5］報道的方法，并進行適當改良。反應在25 mL錐形瓶中進行，反應體積1 mL，含50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)、10 mmol/L的L－半胱氨酸、2 mmol/L的5’－磷酸吡哆醛和12%W/V腦組織勻漿。在中央室中加入1%的0.5 mL醋酸鋅，放入濾紙(0.5 cm×1.5 cm)增加吸收面積。用氮氣將錐形瓶充盈30 s后石蠟膜封口，轉移到37℃水浴搖床中開始反應，90 min后向其中注入0.5 mL的50%三氯乙酸中止反應，繼續水浴60 min后向中央室內加入50 μL的N，N－二甲基對苯二胺鹽酸鹽(20 mmol/L)/HCl(7.2 mol/L)緩沖液及50 μL的FeCl3(30 mmol/L)/HCl(112 mol/ L)緩沖液。充分混勻。20 min后，用全自動酶標儀在波長670 nm測定吸光度，根據H2S標準曲線計算溶液中H2S濃度，組織中CBS活性以單位重量的腦組織在單位時間內生成H2S的量(nmol·g－1·h－1)表示。

2.6 腦組織中H2S含量測定參照文獻［6］用0～4℃的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)制備勻漿(12%W/V)，勻漿液離心(12 000×g、10 min、4℃)，取75 μL上清液移至另一離心管中，在室溫下加入0.25 mL的1%醋酸鋅及0.45 mL蒸餾水孵育10 min，然后加入10%三氯乙酸0.25 mL，再次離心12 000×g、10 min、4℃)，收集清澈的上清液，加入133 μL的N，N－二甲基對苯二胺鹽酸鹽(20 mmol/L)/ HCl(7.2 mol/L)緩沖液及133 μL的FeCl3(30 mmol/L)/HCl(1.2 mol/L)緩沖液，充分混勻。20 min后，用全自動酶標儀在波長670 nm測定吸光度，根據H2S標準曲線計算溶液中的H2S含量，H2S含量以單位重量的腦組織中H2S的量(nmol/g)表示。2.7腦組織學檢查實驗結束時，取大鼠腦組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制成5 μm厚切片，常規HE染色，進行光鏡觀察。

2.8 海馬神經元凋亡檢測采用TUNEL方法。腦組織石蠟切片常規脫蠟至水，依次加入蛋白酶K、TUNEL反應混合液和辣根過氧化物酶，DAB顯色，蘇木精復染。凋亡細胞核染色呈棕褐色。

3 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 11.5軟件進行統計分析。組間差異用單因素方差分析(one－way ANOVA)，并用Student－Newmen－Kuels q檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義

結果

1 腦組織中CBS mRNA表達的變化

假手術組和單純缺血組大鼠腦組織中CBS mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)。與假手術組相比，肢體缺血再灌注3 h后腦組織CBS的mRNA表達開始上調(P＜0.05)，再灌注6 h上調明顯(P＜0.01)，再灌注12 h表達至峰值(P＜0.01)，再灌注至24 h與假手術組比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of CBS at different time points in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 3 h group;△P＜0.05 vs IR 6 h group.圖1 大鼠肢體缺血-再灌注各時點腦組織CBS mRNA的表達

2 腦組織中CBS蛋白表達的變化

Western blotting實驗結果顯示，假手術組和單純缺血組大鼠腦組織中CBS蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05)。與假手術組相比，肢體缺血再灌注3 h后，大鼠腦組織中CBS蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)，再灌注6 h后腦組織CBS蛋白表達開始上調(P＜0.05)，再灌注12 h上調至峰值(P＜0.01)，24 h時恢復至正常水平(P＞0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of CBS at different time points in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs IR 6 h group.圖2 大鼠肢體缺血-再灌注各時點腦組織CBS蛋白的表達

3 腦組織中CBS活性和H2S含量的變化

假手術組和單純缺血組大鼠腦組織中H2S含量和CBS活性差異均沒有統計學意義。與假手術組相比，肢體缺血再灌注3 h和6 h后，大鼠腦組織中CBS活性和H2S含量均無明顯變化，再灌注12 h后大鼠腦組織中H2S含量及CBS活性均顯著升高(均P＜0.01);而IR 24 h組大鼠逐漸恢復正常水平，與假手術組相比沒有明顯差異，見圖3、4。

Figure 3.The change of CBS activity in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=8.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 12 h group.圖3 大鼠肢體缺血-再灌注時腦組織中CBS活性變化

Figure 4.The change of H2S concentration in rat brain tissues after limb IR.Mean±SD.n=8.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 12 h group.圖4 大鼠肢體缺血-再灌注時腦組織中H2S含量變化

Figure 5.Microphotographs showing structural changes in cerebral cortex of rats from different groups(HE staining，×400).圖5 光鏡下各組大鼠大腦皮質的組織形態學改變

Figure 6.Microphotographs showing structural changes in hippocampus of rats from different groups(HE staining，×400).圖6 光鏡下各組大鼠海馬的組織形態學改變

4 腦組織形態學的變化

光鏡觀察顯示:假手術組腦組織結構清晰，無明顯異常。單純缺血組腦組織病變輕微，僅見個別神經元胞體、胞核增大，著色變淺。IR組與假手術組相比，大腦皮質和海馬錐體層部分神經元胞體、胞核增大，著色變淺，部分神經元胞體明顯變小，著色加深，細胞周圍出現水腫裂隙。應用HA抑制CBS活性，可使腦組織中H2S組含量降低的同時，光鏡下發現HA組較IR組病變進一步加重，固縮的神經元數目增多，海馬放射層纖維明顯水腫，紋理模糊不清，見圖5、6。

5 海馬神經元凋亡數目的變化

TUNEL染色顯示，假手術組和單純缺血組偶有TUNEL陽性細胞，兩組陽性細胞數相比沒有顯著差異(P＞0.05)。IR組可見大量棕黃色著色的TUNEL陽性細胞，陽性細胞數與假手術組相比，TUNEL陽性細胞數量明顯增加(P＜0.01)。應用HA抑制CBS活性，可使腦組織中H2S組含量降低的同時，光鏡下發現HA組較IR組病變進一步加重，TUNEL陽性神經元數與腦缺血組相比明顯增多(P＜0.01)，見圖7。

Figure 7.The changes of TUNEL staining－positive cell number in hippocampus of rats.Mean±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs IR 12 h group.The scale bar=21.2 μm.圖7 TUNEL染色結果

討論

H2S是公認的第3種氣體信號分子，在神經系統發揮重要的生理作用。內源性H2S是由含硫氨基酸被磷酸吡多醛－5’－磷酸依賴性酶［包括CBS、胱硫醚γ－裂解酶(cystathionine γ－lyase，CSE)］、半胱氨酸轉移酶等催化產生的。其中，CBS高度表達于神經系統［7］，是腦內產生H2S的主要酶，CBS基因敲除后的小鼠腦內幾乎測不到H2S，改變CBS的活性可以調節H2S的生成［8］，所以本研究檢測了腦組織中CBS表達和活性的變化。在腦組織中，大腦皮質和海馬神經細胞對缺血、缺氧損傷最敏感，故本研究選擇大腦皮層和海馬組織。結果顯示，大鼠肢體IR后腦組織CBS mRNA與蛋白的表達水平明顯上調，活性明顯增強，腦組織內H2S生成明顯增多。并且發現，肢體IR腦組織中CBS/H2S體系的表達上調呈時間依賴性。

肢體缺血是一種常見的臨床病征，再灌注可能加重局部組織的損傷，嚴重時尚可造成遠隔器官如腦的損傷。目前認為此種腦損傷的發生與氧化應激有關［9］。肢體IR后，血液中超氧陰離子等各種自由基含量急劇上升，同時腦組織內誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及其產物NO被大量誘生，NO與超氧陰離子快速結合生成氧化性更強的過氧亞硝基陰離子(ONOO－)，使肢體IR引發的自由基反應在腦內被擴展加強［10］。針對氧化性損傷，組織細胞可產生多種抗氧化酶。其中血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)亞型HO－1是細胞對抗應激反應和抗氧化損傷的重要組成部分，我們以往的研究證實，肢體IR時腦內HO－1被激活并參與了抗損傷的過程。據此，我們認為肢體IR所致腦組織損傷是一種過氧化損傷，以HO－1被激活類似，腦組織表達CBS也是針對氧化損傷的應激反應。

目前多項離體研究發現，H2S作為一種內源性的抗氧化劑，在氧化應激時能夠清除羥自由基等活性簇，對神經細胞起保護作用;還能保護神經元免受興奮性氨基酸(谷氨酸)、過氧化亞硝酸基和次氯酸導致的氧化應激［11］。Kimura等［12］通過對原代培養的皮質神經元研究發現，H2S以一種劑量依賴的方式保護神經元免受谷氨酸的氧化毒性，發揮抗氧化應激的作用，并且發現H2S不是直接作為抗氧化劑來發揮作用的，而是通過增加細胞內抗氧化劑谷胱甘肽的合成，保護神經元免受氧化應激。對于培養HT22細胞株，H2S除了使細胞內谷胱甘肽水平升高之外，還能通過激活ATP敏感的鉀通道和氯通道保護神經元免受谷氨酸的氧化毒性作用。Whiteman等［13］已經研究證明，在培養的SH－SY5Y細胞中，H2S具有和還原型谷胱甘肽類似的作用，能以濃度依賴方式抑制過氧化亞硝酸介導的酪氨酸硝化。

腦組織中CBS/H2S體系在肢體缺血－再灌注過程中發生了動態變化，那么H2S在此過程中起保護作用還是損傷作用?本實驗在CBS/H2S體系表達上調的高峰點(再灌注12 h)用工具藥羥胺(HA)抑制CBS活性，發現腦組織中H2S的生成明顯減少，同時導致肢體IR所引起的腦組織損傷(結構損傷及海馬神經元凋亡)加重，包括光鏡下的結構損傷及出現海馬神經元的凋亡。這提示外周器官IR損傷對腦組織CBS表達具有誘導作用，腦組織所誘生的CBS具有細胞保護效應，尋求無創性手段主動調控CBS表達水平，可為防治器官IR引發多器官功能障礙提供新的對策。同時，有研究表明，外源性H2S通過抑制iNOS/NO、激活HO－1/CO減輕了大鼠腦缺血－再灌注損傷［14］，我們將會進一步研究H2S在肢體IR腦損傷過程中的抗氧化應激機制。

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Changes of CBS expression in brain following ischemia and reperfusion of limbs

WANG Yu－ling1，MA Hua－min2，WANG Bing1，ZHANG Yan1，HUANG Xin－li3

(1Department of Neurology，2Department of Pharmacy，The Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China;3Department of Pathophysiology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China.E-mail:huangxinli2008@126.com)

AIM:To detect the changes of cystathionine β－synthase(CBS)expression in the brain following ischemia－reperfusion of hind limbs in the rats and to elucidate their significance.METHODS:Hind limb ischemia was induced by clamping infrarenal aorta with a microvascular clip and brain injury was made by following reperfusion.The brain tissue was obtained from the animals subjected to sham operation，4 h of ischemia without reperfusion and 3 h，6 h，12 h，24 h of reperfusion following 4 h of ischemia.The expression of CBS at mRNA and protein levels was measured at different time points by reverse transcription－polymerase chain reaction(RT－PCR)and Western blotting.The CBS activity and hydrogen sulfide(H2S)concentration in the brain were determined by a universal microplate reader.The observation of pathologic changes of the brain was made following the inhibition of CBS by hydroxylamine.RESULTS:The relative expression of CBS at mRNA and protein levels in IR group significantly increased compared with sham group.It reached a peak at 12 h(P＜0.01)，and returned to baseline at 24 h(P＞0.05).This time course correlated with increased CBS activity and H2S concentration.No statistically significant difference in the above indexes between sham operation group and ischemia group was observed(P＞0.05).Inhibition of CBS activity induced more severe brain injury in IR group.CONCLUSION:Up－regulation of CBS/H2S pathway is involved in the protection for neurons during the ischemia－reperfusion of hind limbs.

Brain;Extremities;Reperfusion injury;Cystathionine β－synthase;Hydrogen sulfide

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.004

1000－4718(2015)02－213－06

2014－09－22

2014－11－05

國家自然科學基金資助項目(No.30800440);河北省自然科學基金資助項目(No.C2008001040;No.H2012206009;No.H2014206093188)

△通訊作者Tel:0311－86265645;E－mail:huangxinli2008@126.com