硫辛酸對LPS誘導的帕金森病小鼠黑質多巴胺能神經元損傷的影響*

李艷花，和青，尉杰忠，劉春云，黃建軍，豐玲，柴智，王青，肖保國△，馬存根，△

(1山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009;2復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025;3同煤集團總醫院神經外科，山西 大同 037003;4山西中醫學院“2011”協同創新中心，衛生部臨床重點專科，山西 太原 030024)

硫辛酸對LPS誘導的帕金森病小鼠黑質多巴胺能神經元損傷的影響*

李艷花1，和青2，尉杰忠1，劉春云1，黃建軍3，豐玲1，柴智4，王青4，肖保國2△，馬存根1，4△

(1山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009;2復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025;3同煤集團總醫院神經外科，山西 大同 037003;4山西中醫學院“2011”協同創新中心，衛生部臨床重點專科，山西 太原 030024)

目的:探討硫辛酸(LA)對脂多糖(LPS)誘導的帕金森病(PD)模型小鼠黑質多巴胺(DA)能神經元損傷的作用及機制。方法:10月齡雌性C57BL/6小鼠，隨機分為生理鹽水對照組、PD模型組和LA干預組。采用鼻腔滴入LPS制作PD小鼠模型，通過爬竿實驗及酪氨酸羥化酶和p－NF－κB/p65的免疫組化技術觀察LA對DA能神經元的保護作用。結果:LPS經鼻可以成功誘導小鼠PD模型，給予LA可明顯恢復小鼠運動，減少黑質DA能神經元的丟失、抑制小膠質細胞及其NF－κB信號通路激活。結論:LA干預可緩解LPS經鼻誘導的小鼠PD行為學和病理學的改變，其作用機制可能與抑制腦內的炎癥反應有關。

脂多糖;帕金森病;硫辛酸;小膠質細胞

帕金森病(Parkinson disease，PD)是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的第2大神經變性疾病，55歲以上人群中發病率高達1%，在全世界范圍內有大約650萬患者。近年來，人們發現腦內小膠質細胞(microglia，MG)的炎癥反應與PD之間存在著重要聯系［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，是常用的促炎癥反應物質，可以激活小膠質細胞［2］。前期研究發現LPS可以通過多種途徑制備PD模型:如黑質內注射、體循環注射、子宮內注射以及蒼白球內注射等途徑，這些途徑均可以引起黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元的丟失［3］。硫辛酸(lipoic acid，LA)是存在于線粒體α－酮酸氧化脫氫酶系中一個重要的輔助因子，作為強而有效的抗氧化劑被廣泛使用，主要通過清除體內的氧自由基和動員機體內源性的抗氧化劑的生成發揮作用［4－5］。除此之外，近幾年發現，LA也兼具抗炎和神經保護作用，能明顯抑制LPS誘導的NF－κB信號通路的激活，保護DA能神經元抵抗魚藤酮誘導的損傷［6］，保護神經元抵抗低氧、谷氨酸鹽和金屬離子誘導的損傷［7］，保護皮層神經元抵抗β－淀粉樣蛋白和H2O2誘導的損傷［8］。但LA在LPS誘導的PD炎癥模型中的作用及其機制仍不清楚。

材料和方法

1 實驗動物及模型制備

健康雌性C57BL/6小鼠，10月齡，體重22～25 g，由北京維通利華動物有限公司提供，清潔級飼養，自由飲食1周。乙醚麻醉小鼠約10 s后，手持其頸部，鼻孔向上，使用微量移液器將LPS(1 g/L，溶解在生理鹽水中)緩慢滴入小鼠的鼻孔內，并停留一會兒(大約10 s)，使藥液充分滲入，每側鼻孔10 μL。每天給予1次，持續1個月。對照組滴入相同體積的生理鹽水［9］。

2 動物分組及LA干預

用生理鹽水將LA配制成10 g/L，在滴注LPS后的第3天開始給予，持續給藥至30 d。24只小鼠隨機分為①生理鹽水對照組saline組:鼻腔滴注生理鹽水;②PD模型組(LPS組):鼻腔滴注LPS;③LA治療組(LPS+LA組):鼻腔給予LPS，3 d后同時雙側鼻腔各給予10 μL的LA。

3 行為學觀察和標本采集

給藥27 d時，動物進行行為學實驗，用爬竿實驗來評價動物運動協調性。將一個直徑為1 cm，長為58 cm的木桿纏繞兩層紗布，頂端固定一個方形木塞。持小鼠尾部將其放于木塞，頭部朝下，讓其自然下爬，記錄小鼠在木塞上轉頭的時間和從竿頂爬至竿底平臺的時間。正式測試之前，預先練習5次，然后測試3次，每次測試時間不超過3 min，超過3 min，以3 min記錄。連續測試3 d。

行為學實驗之后，每只腹腔注射50 mg/L水合氯醛0.2 mL，生理鹽水灌流。冰上解剖，每組4只分離黑質，制備蛋白質勻漿，－70℃保存。其余4只用4%多聚甲醛灌注固定后，快速取腦組織，用OCT包埋制作冰凍切片(10 μm)，用于免疫熒光染色。

4 免疫熒光染色

取黑質區腦組織切片，PBS洗3次，每次5 min，分別用稀釋于1%BSA－PBS溶液中的抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(Millipore)、抗CD11b抗體(eBioscience)、抗磷酸化(phosphorylated，p)－NF－κB/p65抗體(Cell signaling)4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min，再加入相應的II抗，室溫孵育1.5 h，PBS洗3次，50%甘油封片。用Olympus正置熒光顯微鏡觀察各種抗體的免疫染色活性并攝片。

5 Western blotting

上述蛋白質勻漿用BCA試劑盒檢測濃度，將濃度均調成10 g/L。每種蛋白樣品上樣80 μg，SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳1.5～2.0 h。200 mA、1.5 h將蛋白質轉移到PVDF膜上，加入抗TH抗體，4℃孵育過夜，PBST(含0.3%吐溫的PBS溶液)洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記的IgG抗體室溫下孵育1.5 h，PBST洗3次;ECL(Life Sciences)顯影，Bio－Rad化學發光儀采集發光信號，Image 4.0進行灰度處理。

6 統計學處理

所有實驗均重復至少3次，數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 5(Cabit Information Technology)，采用t檢驗對實驗數據進行統計分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。每個腦組織的黑質區腦片分別選取第5張、25張、50張和75張行TH抗體免疫熒光染色，使用IMAGE－PRO PLUS軟件對TH細胞進行連續計數，總數被用作統計分析。

結果

1 LA改善LPS誘導的PD模型小鼠的運動功能

在模型制備的第27天，3組動物行爬竿實驗，分別記錄爬竿時間和在竿頂轉頭的時間。結果顯示鼻腔給予LPS的小鼠從竿頂爬到地面平臺所需時間為(12.14±5.13)s，在竿頂轉頭的時間為(6.82± 3.25)s。然而生理鹽水對照組小鼠所需時間分別為(9.52±2.55)s、(2.23±1.30)s，2組之間差異明顯，說明LPS明顯損害了小鼠的運動協調功能。LA治療明顯減少了小鼠到達平臺所需的時間和竿頂轉頭的時間(P＜0.05)，說明LA能明顯改善LPS誘導的PD模型鼠的運動功能，見圖1。

Figure 1.LA improved the behavior symptoms of LPS－induced PD mice.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs LPS group.圖1 LA改善LPS誘導的PD模型小鼠的運動功能

2 LA保護黑質區TH神經元免受LPS損傷

黑質區TH免疫熒光染色結果表明，3組小鼠黑質均檢測到TH陽性DA能神經元，對照組TH陽性DA能神經元數量較多，胞體飽滿，邊緣清晰;然而LPS誘導的PD模型組TH陽性DA神經元數量較對照組明顯減少(P＜0.01)，胞體輪廓模糊;LA組黑質TH陽性神經元數量與PD組相比明顯增加(P＜0.05)，神經元形態清晰，與生理鹽水對照組相似，見圖2。

Figure 2.LA prevented TH－positive dopaminergic neurons in the substantia nigra(SN)from LPS－induced injury.A:immunohistochemistry of TH－positive dopaminergic neurons in the SN of mice，and quantitative analysis was done;B:Western blotting analyses of TH in protein extracts from the brain in mice，with the results expressed as the ratio of TH/GAPDH.Mean± SD.n=8.*P＜0.05 vs LPS group.圖2 LA保護黑質區TH神經元免受LPS誘導的損傷

3 LPS誘導NF-κB信號通路的活化

在LPS給予0 d、7 d、14 d、21 d和30 d分別處死4只小鼠，制作黑質區腦組織切片，行p－NF－κB/ p65免疫熒光染色，結果顯示:在0 d、7 d和14 d的小鼠黑質區僅有零星的p－NF－κB/p65染色陽性細胞，而在21 d和30 d的小鼠腦組織中，則有大量的p－NF－κB/p65染色陽性細胞，并與第0天處死的小鼠腦組織中p－NF－κB/p65陽性細胞數相比具有顯著差異，說明LPS可能在第14天～21天期間激活了腦內NF－κB信號通路，見圖3。

Figure 3.NF－κB signal pathway was activated on day 14～21 after LPS treatment in brain of mice.A:representative microphotographs for expression of p－NF－κB/p65 in the substantia nigra(SN)of mice;B:quantative analysis of p－NF－κB/p65 positive cells in the SN of mice.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 d.圖3 LPS在第14～21天時誘導小鼠腦組織NF-κB信號通路的活化

4 LA抑制小膠質細胞的NF-κB信號通路激活

采用MG特異性抗體行腦片黑質區免疫熒光染色，結果顯示:生理鹽水對照組MG為分枝樣，突起細小，無明顯胞體，染色較淺，說明該組MG處于靜息狀態。然而，LPS誘導的PD模型組大量的MG表現為胞體變圓，突起增粗，分枝增多，染色較深等特點，暗示該組SN區的MG呈激活態。給予LA治療的小鼠，其SN區的MG與對照組相似，也處于靜息狀態。由此可見，LA可以抑制LPS誘導的MG激活。進一步用p－NF－κB/p65的抗體標記上述腦片發現，LPS誘導的PD模型組有大量的MG表達p－NF－κB/p65，而對照組和治療組則幾乎沒有p－NF－κB/ p65表達，說明LA可以抑制MG的NF－κB信號蛋白的激活與表達，見圖4。

討論

PD是以進行性黑質部DA能神經元減少為特征的神經變性疾病，主要表現為運動障礙，確切發病機制至今未明［9］。因此，一種理想的可以模擬PD臨床和病理特征的動物模型對于研究PD的發病機制和治療干預顯得非常重要。目前，常用的PD動物模型主要是一些神經毒物模型，用于引發PD的神經毒物主要包括6－OHDA、MPTP、百草枯、魚藤酮等［3］。然而，這些物質誘導的PD模型均有局限性，如6－OHDA必須要腦內定向注射，MPTP自然界并不存在，成模率不穩定，毒性大。另外，這些神經毒物的人工暴露路徑可能也不是PD患者致病的真實途徑。目前認為PD環境毒物暴露可能包括口服和經鼻2個途徑［3］。LPS在自然界中普遍存在，包括空氣中的塵埃、細顆粒物(particulate matter，PM)等污染物，有可能經鼻避開血腦屏障(blood brain barrier，BBB)直接進入腦內誘導PD的發生。有研究表明，在腦室內注射大劑量LPS，1 h之后就有小膠質細胞激活，24 h后部分小膠質細胞進一步激活成“阿米巴樣”，黑質部可見一些圓形的膠質細胞［10－11］，說明LPS能通過激活中樞炎癥反應而導致PD的發生，但是這種立體定向注射技術操作難度較大，一次性給予LPS(100 μg)的濃度太高，并不能真正模擬正常的慢性炎性病理狀態，限制了該LPS誘導的PD模型的廣泛應用。也有人通過腹腔注射LPS(5 mg/kg)成功誘導PD模型［12－13］，但是腹腔注射可引發炎癥反應以及隨后的體液免疫反應和肝腎功能的損害。Tonelli等［14］已證實經鼻暴露LPS能激活嗅覺上皮細胞內的炎癥反應，同時還導致嗅覺神經元的丟失，這一現象可能可以用來解釋早期PD患者嗅覺減退的臨床癥狀。鼻炎增加PD的發病風險，也可能與鼻炎的感染源釋放了過多的LPS相關，這些研究結果提示鼻腔LPS暴露途徑可能是一個合理制備PD模型的方法［3］。2013年，有學者通過LPS經鼻暴露成功制備了PD模型，本研究采用LPS長時間、低劑量滴鼻持續給予C57BL/6小鼠成功獲得了理想的PD動物模型［3，9］。結果顯示鼻腔滴入LPS可以誘導小鼠運動功能改變，引發黑質多巴胺能神經元的丟失、激活小膠質細胞及其NF－κB信號通路，而且還發現持續給予LPS至14～21 d時就能明顯地激活NF－κB信號通路。

在哺乳動物體內，LA是線粒體α－酮酸氧化脫氫酶的一個輔助因子，通過清除體內的氧自由基和動員機體內源性的抗氧化劑的生成發揮作用［15］。具有水溶性、脂溶性和分子量小等特點，能容易地通過BBB［16］。最近研究發現LA兼具有抗炎和神經保護作用，能明顯抑制LPS誘導的NF－κB信號通路的激活，保護皮層神經元抵抗β－淀粉樣蛋白和H2O2的損傷［8］。膳食中補充LA可以抑制IL－6和TNF－α的表達［17］。通過抑制LPS對NF－κB和AP－1信號蛋白的激活，下調LPS誘導的NO和TNF－α的產生［18］。體外BV－2細胞實驗也顯示，LA通過抑制GSK－3β、PI3K和激活Akt信號通路來抑制LPS誘導的炎癥反應［19］。LA具有保護PC12神經元免受MPTP毒性損害的作用［20］。上述研究人員主要是通過體外實驗發現了LA能夠明顯抑制刺激物誘導的炎癥反應及神經損傷，然而并未有研究人員從體內探討LA的神經保護作用，因此本研究利用LPS經鼻誘導的小鼠PD模型，采用免疫熒光染色及Western blotting技術檢測了黑質TH數量，CD11b陽性小膠質細胞形態和p－NF－κB蛋白的表達情況，并結合爬竿實驗，探討了LA對LPS所致小鼠黑質DA能神經元損傷的保護作用和機制。結果顯示，與PD組相比，LA可明顯恢復小鼠運動，減少黑質多巴胺能神經元的丟失、抑制小膠質細胞及其NF－κB信號通路激活，提示LA對LPS誘導的黑質DA能神經元損傷具有保護作用，體內實驗結果與體外實驗結果相似。

綜上所述，我們推測LA干預可能是通過抑制NF－κB活性，抑制小膠質細胞的激活，緩解LPS經鼻引起的小鼠PD行為學和病理學的改變。

Figure 4.LA significantly inhibited NF－κB activation in microglia.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs LPS group.圖4 LA抑制小膠質細胞NF-κB信號通路激活

［1］方鑫.神經炎癥在帕金森病發病機制中的作用［D］.武漢:華中科技大學，2011.

［2］楊麗娟，董軍，陸大祥，等.姜黃素對LPS激活小膠質細胞條件培養基誘導損傷的海馬神經元保護作用及機制［J］.中國病理生理雜志，2010，26(4):742－747.

［3］和青.LPS經鼻小鼠帕金森病模型的建立及Rho酶靶點干預探討［D］.上海:復旦大學，2013.

［4］Smith AR，Shenvi SV，Widlansky M，et al.Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative stress［J］.Curr Med Chem，2004，11(9): 1135－1146.

［5］徐雷，馮波，王華，等.抗氧化劑α－硫辛酸對2型糖尿病大鼠動脈組織NF－κB表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2007，23(12):2474－2475.

［6］Zaitone SA，Abo－Elmatty DM，Shaalan AA.Acetyl－L－carnitine and α－lipoic acid affect rotenone－induced damage in nigral dopaminergic neurons of rat brain，implication for Parkinson's disease therapy［J］.Pharmacol Biochem Behav，2012，100(3):347－360.

［7］Müller U，Krieglstein J.Prolonged pretreatment with alpha－lipoic acid protects cultured neurons against hypoxic，glutamate－，or iron－induced injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1995，15(4):624－630.

［8］Zhang L，Xing GQ，Barker JL，et al.Alpha－lipoic acid protects rat cortical neurons against cell death induced by amyloid and hydrogen peroxide through the Akt signalling pathway［J］.Neurosci Lett，2001，312(3):125－128.

［9］He Q，Yu W，Wu J，et al.Intranasal LPS－mediated Parkinson's model challenges the pathogenesis of nasal cavity and environmental toxins［J］.PLoS One，2013，8 (11):e78418.

［10］呂風月，李軍泉，張海燕，等.腦室內注射脂多糖致腦內炎癥大鼠模型黑質多巴胺能神經元與膠質細胞的早期變化［J］.中國老年學雜志，2009，29(1):1－4.

［11］趙詠梅，李軍泉，呂風月，等.低劑量脂多糖腦室注射對大鼠行為黑質小膠質細胞及多巴胺能神經元的長時程影響［J］.中華行為醫學與腦科學雜志，2011，20 (12):1084－1087.

［12］Liu M，Bing G.Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease［J］.Parkinsons Dis，2011，2011: 327089.

［13］Dutta G，ZhangP，LiuB.Thelipopolysaccharide Parkinson's disease animal model:mechanistic studies and drug discovery［J］.Fundam Clin Pharmacol，2008，22 (5):453－464.

［14］Tonelli LH，Holmes A，Postolache TT.Intranasal immune challenge induces sex－dependent depressive－like behavior and cytokine expression in the brain［J］.Neuropsychopharmacology，2008，33(5):1038－1048.

［15］Smith AR，Shenvi SV，Widlansky M，et al.Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative stress［J］.Curr Med Chem，2004，11(9): 1135－1146.

［16］Goraca A，As?anowicz－Antkowiak K.Prophylaxis with alpha－lipoic acid against lipopolysaccharide－induced brain injury in rats［J］.Arch Immunol Ther Exp(Warsz)，2009，57(2):141－146.

［17］Li Y，Ma QG，Zhao LH，et al.Effects of lipoic acid on immune function，the antioxidant defense system，and inflammation－related genes expression of broiler chickens fed aflatoxin contaminated diets［J］.Int J Mol Sci，2014，15 (4):5649－5662.

［18］Kiemer AK，Müller C，Vollmar AM.Inhibition of LPS－induced nitric oxide and TNF－alpha production by alpha－lipoic acid in rat Kupffer cells and in RAW 264.7 murine macrophages［J］.Immunol Cell Biol，2002，80(6): 550－557.

［19］Koriyama Y，Nakayama Y，Matsugo S，et al.Anti－inflammatory effects of lipoic acid through inhibition of GSK－3β in lipopolysaccharide－induced BV－2 microglial cells［J］.Neurosci Res，2013，77(1－2):87－96.

［20］Li DW，Li GR，Lu Y，et al.α－Lipoic acid protects dopaminergic neurons against MPP－induced apoptosis by attenuating reactive oxygen species formation［J］.Int J Mol Med，2013，32(1):108－114.

Lipoic acid protects dopaminergic neurons in LPS-induced model of Parkinson's disease

LI Yan－hua1，HE Qing2，YU Jie－zhong1，LIU Chun－yun1，HUANG Jian－jun3，FENG Ling1，CHAI Zhi4，WANG Qing4，XIAO Bao－guo2，MA Cun－gen1，4

(1Department of Neurology，Institute of Brain Science，Medical School，Shanxi Datong University，Datong 037009，China;2Institute of Neurology，Huashan Hospital，Institutes of Brain Science and State Key Laboratory of Medical Neurobiology，Fudan University，Shanghai 200025，China;3Department of Neurosurgery，First Hospital，Datong Coalmine Group，Datong 037003，China;4"2011"Collaborative Innovation Center/Department of Encephalopathy and National Major Clinical Department of Ministry of Health，Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM:To evaluate the effect of lipoic acid(LA)on LPS－induced Parkinson disease(PD)model of mice.METHODS:Female C57BL/6 mice of 10－month－old were randomly divided into saline control group，PD group and LA group.The PD mouse model was induced by intranasal instillation of LPS.Assays of tyrosine hydroxylase，microglia and nuclear factor kappa B(NF－κB)were performed by the methods of immunohistochemistry and Western blotting.RESULTS:Intranasal LPS instillation exhibited basic characteristics of PD model.However，LA administration significantly improved motor dysfunction，protected dopaminergic neurons from damage，and inhibited NF－κB activation in inflammatory microglia in the substantia nigra area of the brain.CONCLUSION:LA may exert a profound neuroprotective effect by anti－neuroinflammatory reaction to arrest the progression of PD.

Lipopolysaccharide;Parkinson disease;Lipoic acid;Microglia

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.002

1000－4718(2015)02－201－06

2014－09－11

2014－10－12

國家自然科學基金資助項目(No.81272163);山西省青年自然科學基金資助項目(No.2012021034－2);山西大同大學博士科研啟動經費(No.2011－B－11);山西大同大學研究所科研項目啟動經費;山西中醫學院“2011”培育計劃項目(No.2011PY－1)

△通訊作者Tel:0351－3179809;E－mail:macungen2001@163.com