糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細胞BKCa通道的變化*

胥建輝，侯曉鈺，趙宏賢(成都醫學院體溫與炎癥四川省高校重點實驗室，第一附屬醫院產科，四川成都60500;瀘州醫學院基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，四川瀘州646000)

糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細胞BKCa通道的變化*

胥建輝1，侯曉鈺2，趙宏賢3△
(成都醫學院1體溫與炎癥四川省高校重點實驗室，2第一附屬醫院產科，四川成都610500;3瀘州醫學院基礎醫學院組織學與胚胎學教研室，四川瀘州646000)

［摘要］目的:探討糖尿病胃輕癱( DGP)的發病機制與胃平滑肌細胞大電導鈣激活鉀通道( BK(Ca))變化之間的關系。方法:將大鼠分為對照組和糖尿病胃輕癱模型組。應用木瓜蛋白酶液急性酶分離大鼠胃平滑肌細胞，采用單通道膜片鉗技術記錄大鼠胃平滑肌細胞BK(Ca)電流，免疫組織化學技術測定BK(Ca)蛋白KCNMA和KCNMB1的表達。結果:大鼠胃平滑肌細胞BK(Ca)電流的開放具有電壓依賴性和胞內鈣離子濃度依賴性，可被鉀離子通道阻滯劑IbTX阻斷;模型組大鼠胃平滑肌細胞BK(Ca)開放概率及開放幅度增加( P＜0.05)，平均開放時間及平均關閉時間減少( P＜0.01) ;模型組大鼠胃平滑肌細胞KCNMB1蛋白表達增加( P＜0.01)，KCNMA蛋白表達無明顯變化。結論: DGP發病與胃平滑肌細胞BK(Ca)β1亞基蛋白表達上調及通道功能活動增強有關，β1亞基蛋白可能通過調節BK(Ca)功能活動參與DGP的發生。

［關鍵詞］糖尿病胃輕癱;大電導鈣激活鉀通道;胃平滑肌細胞

平滑肌的收縮和舒張是胃腸道運動的基礎。平滑肌細胞膜電位去極化與細胞膜上鈣通道開放引起的鈣離子內流可導致平滑肌收縮;鉀通道開放，鉀離子外流可導致細胞膜電位超極化，鈣離子內流減少，平滑肌舒張。大電導鈣激活鉀通道( large-conductance calcium-activated potassium channels，BKCa)是平滑肌上重要的鉀離子通道，在平滑肌細胞中分布廣泛;其電導值大，相對少的通道激活即可對平滑肌細胞的膜電位產生較大的影響;它接受細胞膜電位與胞內鈣離子濃度的雙重調節，在平滑肌收縮-舒張調節中起著重要作用。文獻報道小鼠胃和結腸平滑肌細胞膜上的BKCa表達高于十二指腸、回腸部位，胃和結腸具有的容受性舒張特點可能與BKCa有關［1］，可見BKCa與胃的動力特性有著密切的關系。

糖尿病胃輕癱( disbetic gastroparesis，DGP)是糖尿病常見慢性并發癥，主要特點為胃動力下降、排空延遲、節律紊亂;見于Ⅰ型、Ⅱ型糖尿病，發病率約50%［2］。文獻報道，DGP發病與胃腸激素及胃腸道神經系統的變化有相關性［3］;胃腸激素及胃腸道神經系統可直接影響胃腸道平滑肌細胞BKCa的功能狀態［4-6］;而且研究發現，糖尿病可直接導致大鼠冠狀動脈平滑肌細胞上BKCa電流活動和其β1亞基蛋白表達異常［7］。因此，我們推測DGP發生時，BKCa結構與功能狀態可能發生異常，進而影響胃平滑肌的生理功能，BKCa可能在DGP發病中起了一定的作用。

材料和方法

1動物

健康純系雄性SD大鼠50只，體重250 g左右，由瀘州醫學院動物科提供。

2主要試劑

鏈脲菌素( streptozotocin，STZ)、木瓜蛋白酶、DTT、白蛋白、免抗BKCaβ1和α亞基蛋白( KCNMB1 和KCNMA)抗體均購自Sigma。

3實驗方法

3.1動物分組及造模采用以往研究報道的方法［8］。健康純系雄性SD大鼠50只，隨機分為對照組( n =20)和模型組( n =30)。模型組用0.1 mmol/ L檸檬酸緩沖液配制的2% STZ 60 mg/kg一次性腹腔內注射，3 d后，禁食不禁水6 h，采尾血測空腹血糖，選取血糖≥16.9 mmol/L大鼠繼續進行實驗;對照組用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液2 mL/kg一次性腹腔內注射，2組均給予標準鼠飼料繼續喂養。10周后測量大鼠空腹血糖及體重，1 g/L美藍溶液0.4 mL灌胃，30 min后處死大鼠，將胃內殘留物用生理鹽水沖洗并收集沖洗液，離心取上清液，用722分光光度計在640 nm波長檢測吸光度( A)值，測量胃內色素殘留率。血糖濃度≥16.9 mmol/L、胃排空率(胃內色素殘留率)顯著下降表明大鼠DGP模型造模成功。

3.2實驗溶液的配制低鈣生理溶液( mmol/L) : NaCl 135，KCl 6，MgCl21.2，HEPES 10，CaCl20.05，用NaOH調pH至7.40，用于組織保存和酶分離。單通道電極液( mmol/L) : KCl 100，K-aspartate 40，HEPES 10，EGTA 2，用KOH調pH至7.20～7.40。單通道浴液( mmol/L) : KCl 40，K-aspartate 100，EGTA 1，HEPES 10，用KOH調pH至7.20～7.40。以上電極液與浴液為對稱性高鉀溶液(［K+］o: ［K+］i=140 mmol/L∶140 mmol/L，［Ca2 +］free=0)。3.3急性酶分離SD大鼠胃平滑肌細胞將大鼠禁食不禁水24 h后處死，開腹取胃，剪開胃部，用無鈣生理溶液漂洗干凈，體式顯微鏡下剝下肌層，沿肌條方向剪成1 mm×3 mm的組織條塊，置于由2.0 g/L木瓜蛋白酶，2.0 g/L DTT，3.0 g/L白蛋白配置的低鈣生理溶液中保存20 min后放入木瓜蛋白酶酶液，于37℃恒溫水浴箱中振蕩消化15 min，顯微鏡下觀察控制消化時間，如鏡下見到細胞膜完整光滑，折光性好，即可終止酶解。

3.4單通道膜片鉗技術記錄大鼠胃平滑肌細胞BKCa電流選擇呈梭形、貼壁良好、胞膜完整和折光性好的平滑肌細胞進行實驗。操縱膜片鉗微推進器使電極尖端貼附在細胞表面，在示波器上可見應答電流下降，稍加負壓即可見應答電流下降至零，此時阻抗可高達10 GΩ以上，表明高阻封接已經形成，這樣就形成了細胞貼附式膜片( cell-attached patch)。高阻封接形成后，迅速將微管電極尖端拉出液氣交界面2～3 s，再放回浴槽中，即形成內面向外式膜片( inside-out patch)。采樣頻率設置為10 kHz，采樣方式為Gap Free，采樣時間30 s。本實驗采用細胞貼附式膜片和內面向外式膜片記錄BKCa電流。

3.5免疫組織化學技術測定BKCa蛋白KCNMA和KCNMB1的表達按抗體說明書操作步驟進行免疫組織化學檢測。采用OLYMPUS IX71光學照相系統拍照，Image-Pro-Plus 6.0軟件進行圖形數據分析。

4統計學處理

單通道膜片鉗實驗所得數據采用pCLamp 10.1軟件自動測量開放概率( open probability，NPO)、平均開放時間( mean open time，TO)、平均關閉時間( mean close time，TC)、電流幅度( amplitude of current，Amp)。用Origin 8作直線擬合及圖形處理。用Image-Pro-Plus 6.0分析軟件對免疫組織化學檢測結果進行半定量分析。實驗數據以均數±標準差( mean ±SD)表示，采用SPSS 14.0統計軟件對數據進行分析，數據統計采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1大鼠DGP模型造模情況

實驗過程中模型組大鼠死亡10只，最終納入實驗的模型組大鼠16只，對照組大鼠16只。處死前，模型組大鼠的平均體重( 190. 00 g±23. 71 g)明顯低于對照組( 428. 00 g±25. 05 g)。處死前，模型組大鼠平均血糖濃度為30. 26 mmol/L±2. 19 mmol/L，大于16. 9 mmol/L，且明顯高于對照組( 4. 83 mmol/L± 1. 09 mmol/L)。模型組大鼠胃內美藍殘留率( 54. 50 mmol/L±3. 92 mmol/L)明顯高于對照組( 40. 69 mmol/L±3. 55 mmol/L)，胃排空率顯著下降( P＜0. 01)。大鼠血糖濃度及胃排空率情況提示大鼠DGP模型造模成功。

2急性酶分離胃平滑肌細胞形態學表現

急性酶分離的大鼠胃平滑肌細胞數量多，活性較強，形態大多呈長梭形，細胞膜完整，表面光滑，外周有光環，折光性好，立體感強，細胞質內無顆粒狀物，見圖1。

Figure 1.Photograph of a freshly isolated SD rat gastric smooth muscle cell under microscope(×400).圖1　顯微鏡下剛分離的SD大鼠胃平滑肌細胞圖像

3SD大鼠胃平滑肌細胞BKCa單通道特性與鑒別

3.1通道的電導在對稱性高鉀溶液中，鉀離子的平衡電位Ek=0 mV，根據在不同鉗制電壓下的通道電流幅值和對應膜電位繪制電流-電壓關系曲線(圖2)，用軟件Origin 8對I-V曲線進行直線擬合，可見電流電壓呈線性關系，反轉電位接近0 mV，同時可以得到直線斜率為0.205，即該單通道電導值為205 pS。對11個膜片的BKCa單通道電流繪制I-V曲線并作統計學分析可得該通道的電導值為211.7 pS± 13.6 pS。

3.2通道的電壓依賴性在內面向外式膜片下，隨著鉗制電壓由0 mV逐漸上升至60 mV，通道的電流幅值、開放概率和開放時間均呈膜電壓依賴性增加，見圖3。

3.3通道活動的Ca2 +依賴性在內面向外式膜片下( Vm = +40 mV)，浴液中游離Ca2 +濃度分別為0、1×10－7、5×10－7和1×10－6mol/L時，其NPo分別為0. 018±0. 004、0. 048±0. 007、0. 158±0. 020和 0. 500±0. 029，通道的開放概率隨著鈣離子濃度上升而逐漸增加，見圖4。

Figure 2.The current-voltage relationship of BKCain SD rat gastric smooth muscle cells.Mean±SD.n =11.圖2　SD大鼠胃平滑肌細胞BKCa的電流-電壓關系

Figure 3.The voltage dependence of BKCain SD rat gastric smooth muscle cells.圖3　SD大鼠胃平滑肌細胞BKCa的電壓依賴性

Figure 4.The Ca2 +dependence of BKCain SD rat gastric smooth muscle cells( Vm = +40 mV).圖4　SD大鼠胃平滑肌細胞BKCa的Ca2 +依賴性

3.4鉀離子通道抑制劑IbTX對通道的作用在外面向外式膜片下( Vm = + 30 mV)，浴液中加入200 nmol/L BKCa特異性阻斷劑IbTX，膜片外向電流幾乎完全被阻斷，見圖5。

Figure 5.The single channel current of BKCawas suppressed by 200 nmol/L IbTX.圖5　BKCa通道的單通道電流被200 nmol/L IbTX阻斷

4對照組與模型組SD大鼠BKCa通道電流比較

在細胞貼附式膜片下，游離鈣離子濃度為1× 10-7mol/L，膜電位鉗制在+ 40 mV，相比于對照組SD大鼠，模型組胃平滑肌BKCa單通道電流NP0值增加( P＜0.01)、Amp值上升( P＜0.05)、To值下降( P＜0.01)、Tc值降低( P＜0.01 )，見圖6、表1。

Figure 6.Representative single channel currents traces of BKCain control group and model group in cell-attached patch ( Vm = +40 mV).圖6　在細胞貼附式膜片下，具有代表性的對照組與模型組BKCa單通道電流圖形

表1　對照組與模型組BKCa單通道電流特性的對比Table 1.Comparison of characteristics in single channel BKCacurrent between control group and model group ( Mean±SD.n =14)

5免疫組織化學檢測KCNMA和KCNMB1蛋白表達水平

SD大鼠胃平滑肌上可檢測到KCNMA和KCNMB1蛋白表達，蛋白表達水平用積分光密度( IA)值表示。經Image-Pro-Plus 6. 0分析軟件分析，對照組KCNMA蛋白表達IA值為525 875. 5±65 718. 1，模型組KCNMA蛋白表達IA值為493 504. 6±27 916. 2，兩者對比無明顯差異( P＜0. 05) ;對照組KCNMB1蛋白表達IA值為13 558. 2±2 216. 5，模型組為29 801. 6±3 123. 1，兩者對比差異有統計學意義( P＜0. 01)，見圖7、8。

Figure 7.Expression of KCNMA and KCNMB1 proteins was detected by immunohistochemical method in SD rat gastric smooth muscle cells (×200).圖7　免疫組織化學法檢測SD大鼠胃平滑肌細胞KCNMA 和KCNMB1蛋白表達

討論

近年離子通道在胃腸道疾病的研究主要集中在平滑肌和神經系統。平滑肌是胃腸動力的來源，BKCa介導了胃腸道平滑肌的收縮-舒張，接受胃腸激素和胃腸道神經系統的調控，在胃腸道動力疾病中所起的作用逐漸被關注。本實驗結果顯示，DGP模型組胃平滑肌細胞BKCa單通道電流TO值和TC值均減少，NPO值顯著增加，表明通道的功能活動加強。BKCa可通過負反饋系統調控平滑肌細胞張力［9-10］，多項研究表明BKCa功能活動增強可引起平滑肌細胞的張力下降，肌條收縮受到抑制，舒張性增強［11-12］。在胃腸道也有相應的研究:郭力等［13］發現，內毒素/脂多糖和燒傷后豚鼠血清可增強豚鼠結腸平滑肌BKCa功能活動，提示燒傷后發生的內毒素血癥通過增強結腸平滑肌細胞BKCa活動對豚鼠腸道的運動產生抑制作用，并由此引起了燒傷后腸道動力障礙。相反，BKCa功能活動減弱可引起平滑肌細胞的張力增強，肌條收縮性增強，舒張性減弱［14］。如腸易激綜合征是臨床常見胃腸道疾病，女性患者較多，多認為與胃腸動力亢進有關，徐龍等［15］發現，黃體酮可通過激活BKCa抑制豚鼠結腸環形肌收縮，提示腸易激綜合征病人在月經、更年、絕經期腸易激綜合征樣癥狀發生率增高與BKCa相關。本實驗與以上結腸平滑肌的研究類似，DGP大鼠胃平滑肌細胞BKCa功能活動增強可能通過降低胃平滑肌的收縮性、增加其舒張性，參與了胃排空延遲的發生，提示BKCa功能活動增強可

能與DGP發病有關。

Figure 8.Expression level of KCNMA protein and KCNMB1 protein in SD rats gastric smooth muscle cells.Mean±SD.n =5.＊＊P＜0. 01 vs control group.圖8　SD大鼠胃平滑肌細胞KCNMA和KCNMB1蛋白表達水平比較

BKCaα亞基由單基因KCNMA編碼，是BKCa的基本結構功能部分。BKCa已知的β亞基由KCNMB 1～4 4種基因編碼，組織特異性表達的β亞基和α亞基剪切變異體的相互結合是BKCa結構和功能多樣性的基礎［16］。β1亞基是BKCa的調節亞基，可通過修飾BKCa的電壓依賴性和鈣離子敏感性影響通道的動力學特性，它使通道的電壓依賴性減低，電壓感受器對通道的激活作用更加穩定，當通道激活時，電壓處在更負的位置;它對通道的2個鈣離子高親和力結合位點( RCK1、Ca2 +bowl)的鈣離子敏感性有修飾作用［17］。由于BKCa的β1亞基在平滑肌細胞中的表達占據主導地位，平滑肌細胞BKCa的鈣離子敏感性高于腦和骨骼肌等其它組織［18］，因此有關平滑肌BKCa功能活性的研究主要集中在β1亞基。本實驗結果顯示，SD大鼠胃平滑肌細胞均表達KCNMA蛋白和KCNMB1蛋白，DGP大鼠BKCaKCNMB1蛋白表達高于正常組大鼠，β1亞基表達上調。很多研究表明，β1亞基表達改變可引起BKCa動能活性發生改變，并可進一步影響平滑肌的收縮-舒張特性。如Semenov等［19］對平滑肌細胞KCNMB1基因的定向刪除實驗證明，β1亞基缺失的BKCa鈣離子敏感性降低，鈣火花和通道激活之間的偶聯減少，通道開放概率下降，平滑肌張力增加。Sweet等［17］發現，β1亞基表達上調可引起BKCa通道鈣離子敏感性增加，通道開放對電壓的依賴性降低，通道開放概率上升，通道的電流活動加強。Hu等［20］發現，妊娠期婦女子宮動脈平滑肌張力下降與BKCaβ亞基表達上調，通道電流活動增強有關。本實驗DGP大鼠胃平滑肌β1亞基表達上調可能引起BKCa功能活動增強，平滑肌張力下降，提示DGP大鼠胃平滑肌細胞BKCa功能活動增強可能與β1亞基表達上調有關。還有一些在胃腸道的研究發現，胃腸道平滑肌細胞β1亞基表達改變可能通過影響BKCa功能活動引起平滑肌收縮-舒張機制失調，胃腸道動力發生障礙。如杜滂等［21］發現，高膽固醇模型兔奧迪括約肌BKCaβ1亞基表達低于正常兔，提示高膽固醇血癥通過下調奧迪括約肌BKCaβ1亞基表達，降低通道Ca2 +敏感性，引起通道開放異常，奧迪括約肌持續性收縮，膽汁淤積。France等［22］發現，BKCa阻斷劑可導致正常大鼠近端結腸平滑肌細胞去極化且動作電位頻率增加;與正常組相比，KCNMB1基因敲除大鼠食物殘渣排出減少，實驗用玻璃珠排出速度減慢，近端結腸平滑肌收縮性增強，細胞膜電位去極化幅度和頻率增加，提示β1亞基缺陷導致BKCa功能障礙，并進一步引起便秘的發生。綜上所述，本實驗結果提示DGP大鼠胃平滑肌細胞β1亞基表達上調，BKCa功能活動增強，可能引起平滑肌張力下降，大鼠胃排空延遲，β1亞基可通過調節BKCa參與DGP的發生。在后期研究中我們將把BKCa作為靶點篩選兼具降血糖與降低BKCa通道活性的藥物，為DGP的臨床治療提供新的實驗依據。

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Changes of large-conductance calcium-activated potassium channel in gastric smooth muscle cells of diabetic gastroparesis rats

XU Jian-hui1，HOU Xiao-yu2，ZHAO Hong-xian3
(1Key Laboratory of Thermoregulation and Inflammation，Sichuan Higher Education Institutes，2Department of Obstetrics，First Affiliated Hospital，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China;3Department of Histology and Embryology，Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China.E-mail: helloxjh@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To discuss the relevance between the pathogenesis of diabetic gastroparesis and the largeconductance calcium-activated potassium channels ( BK(Ca)) in gastric smooth muscle cells.METHODS: The SD rats were randomly divided into control group and model group.The gastric smooth muscle cells of the SD rats were enzymatically isolated in a low calcium solution containing papain.The current was recorded by patch clamp single channel recording technique.The expression of KCNMA and KCNMB1 were observed by the method of immunohistochemistry.RESULTS: The value of BK(Ca)single channel conductance was ( 220.10±10.90) pS; the channels had distinct voltage dependent and calcium dependent characteristics.In outside-out patch ( Vm = +30 mV)，the activation of BK(Ca)was blocked by 200 nmol/ L IbTX completely.Compared with control group，the open probability and amplitude of current in model group significantly increased，while the mean open time and mean close time significantly decreased.Compared with control group，the expression of KCNMB1 in model group was significantly increased.CONCLUSION: Up-regulation of β1-subunit and increase in BK(Ca)functional activities may be associated with diabetes gastroparesis in rats.

［KEY WORDS］Diabetes gastroparesis; Large-conductance calcium-activated potassium channel; Gastric smooth muscle cells

通訊作者△Tel: 0830-3160073; E-mail: helloxjh@126.com

*［基金項目］四川省衛生廳科研課題( No.100242)

［收稿日期］2014-09-05［修回日期］2015-05-11

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1288-06

［中圖分類號］R587. 1; R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.024