PARP-2在大鼠心肌肥大中的作用*

周廣友，耿　彪，耿　濤，安儒峰，田　芳，劉培慶(泰山醫學院附屬醫院藥劑科，山東泰安7000;中山大學藥學院藥理毒理實驗室，廣東廣州50006)

PARP-2在大鼠心肌肥大中的作用*

周廣友1▲，耿彪1▲，耿濤1，安儒峰1，田芳1，劉培慶2△
(1泰山醫學院附屬醫院藥劑科，山東泰安271000;2中山大學藥學院藥理毒理實驗室，廣東廣州510006)

［摘要］目的:在細胞和整體水平研究多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶2( PARP-2)在心肌肥大過程中表達的變化規律以及PARP-2對心肌肥大的調控作用。方法:健康雄性SD大鼠采用腹主動脈縮窄法( AAC)建立心肌肥大動物模型，采用real-time PCR和Western blot檢測PARP-2的mRNA和蛋白表達變化;使用PARP-2特異性的siRNA干擾序列來處理細胞后，通過檢測心肌細胞表面積及ANF、BNP和β-MHC的mRNA表達變化來作為評判心肌細胞肥大狀況。結果: AAC大鼠心臟組織中PARP-2的蛋白和mRNA表達均顯著上調;在AngⅡ誘導的心肌細胞肥大模型中，AngⅡ能時間和劑量依賴性地上調PARP-2的mRNA和蛋白表達;用siRNA干擾序列沉默PARP-2能夠逆轉AngⅡ所誘導心肌細胞的肥大。結論:在AngⅡ誘導的心肌細胞肥大的體外模型和腹主動脈縮窄誘導的心肌肥大動物的體內模型中，PARP-2的mRNA和蛋白水平均顯著上調;特異性沉默PARP-2能夠抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。

［關鍵詞］多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶2;血管緊張素Ⅱ;腹主動脈縮窄;心肌肥大

▲并列第1作者

早期心肌肥大是心臟對機械負荷及神經體液因子的改變進而維持適當收縮功能的代償反應［1］，但長期應激所導致的持續性病理性心肌肥大可發展為心臟擴大、充血性心力衰竭和猝死，是心功能惡化及心源性死亡的獨立危險因素，其發病機制復雜［2-3］。因此，研究心肌肥大的機制及其防治策略具有十分重要的意義。

多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶［poly ( ADP-ribose) polymerases，PARP］是真核細胞內具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基［poly ( adenosine diphosphate-ribose)，PAR］催化活性的蛋白酶，是以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)為底物催化合成PAR聚合物，在細胞內進行翻譯后修飾，該修飾作用于許多蛋白，涉及到染色體的穩定，DNA損傷修復，基因轉錄，細胞的增長、死亡和凋亡等方面［4-6］。很多研究表明PARP家族與心血管疾病密切相關，PARP的藥理性抑制劑對于很多心血管疾病的動物模型均有明顯改善作用。PARP-1是第1個被發現具有PAR修飾活性的蛋白，也是PARP家族中最為典型的成員。PARP-1在心血管疾病中的研究已經相當深入，其抑制劑在心肌肥厚、心肌缺血及再灌注以及動脈粥樣硬化等疾病中均有明顯作用，一些新型的PARP-1抑制劑已經進入臨床試驗，主要適應癥是惡性腫瘤及嚴重心血管疾病，并顯示出良好的治療效果［7-9］。

PARP家族的另一重要成員PARP-2與PARP-1具有69%的同源性，晶體結構類似，而且二者是PARP家族目前僅有的能夠因DNA的斷裂或損傷而誘發其催化活性的成員，但是PARP-2相對于PARP-1僅占了全部酶活性的5%～10%，二者有不同的DNA結合位點和蛋白靶點，決定了其不同的生理功能［10-11］。關于PARP-2在心肌肥大甚至心血管疾病中的作用報道較少，有待進一步研究。

在本研究中，我們檢測到在血管緊張素Ⅱ( angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導的心肌細胞肥大體外模型和腹主動脈縮窄( abdominal aortic coarctation，AAC)誘導的心肌肥大體內模型中，PARP-2的表達均明顯上調。在此基礎上，我們通過采用RNA干擾( RNA interference，RNAi)的方法，首次證實了下調PARP-2能夠明顯逆轉AngⅡ所誘導的心肌肥大。上述發現提示了PARP-2與心肌肥大的密切關系，也為進一步研發PARP-2特異性的抑制劑防治心肌肥大等心血管疾病提供了科學依據。

材料和方法

1材料

出生1～2 d的Sprague-Dawley( SD)大鼠購自中山大學動物實驗中心，合格證號為0067950。PARP-2抗體和AngⅡ購自Sigma; PARP-2 siRNA(上海吉瑪公司) ; Lipofectamine 2000( Invitrogen)。

2方法

2.1乳鼠心肌細胞培養取出生1～2 d乳鼠心臟，用胰酶消化法，即將剪好的心臟小塊置于配好的胰蛋白酶溶液中，首先冰上冷消化20 min后，37℃水浴多次消化。將乳鼠左心室消化成單細胞懸液，經過差速貼壁分離后，調節細胞密度種于培養皿中，并在DMEM培養基中避光加入0. 1 mmol/L的BrdU以抑制成纖維細胞生長。置于37℃、5% CO2培養箱中孵育48 h更換無血清培養基，進行后續實驗。

2.2大鼠腹主動脈縮窄模型的建立雄性SD大鼠20只，隨機分為2組:假手術組( sham組)和手術組( AAC組)，每組各10只。首先腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉( 40 mg/kg)，常規消毒鋪巾，沿腹腔正中縱行切口，將腹腔打開，分離腹主動脈，旁置1根6號針，使腹主動脈縮窄達70%～80%。假手術對照組只分離腹主動脈，穿線但不結扎，其它步驟同手術組一致。

2.3大鼠超聲心動圖檢測腹主動脈縮窄手術后8周，對大鼠行超聲心動圖檢測。探頭置于大鼠胸骨左側，取胸骨旁左室長軸和短軸切面。利用二維超聲引導M型曲線并進行測量。超聲心動檢測指標包括左室舒張末期內徑( left ventricular internal dimensions at end-diastole，LVIDd)、左室收縮末期內徑( left ventricular internal dimensions at end-systole，LVIDs)、舒張末期室間隔厚度( interventricular septal wall dimensions at end-diastole，IVSd)、收縮末期室間隔厚度( interventricular septal wall dimensions at end-systole，IVSs)、舒張末期左室后壁厚度( left ventricular posterior wall dimensions at end-diastole，LVPWd)、收縮末期左室后壁厚度( left ventricular posterior wall dimensions at end-systole，LVPWs)、左室長軸縮短分數( fractional shortening，FS)和射血分數( ejection fraction，EF)。

2.4Real-time PCR實驗按照TRIzol說明書步驟提取細胞總RNA，利用紫外分光光度儀測定RNA的濃度和純度。參照TaKaRa的SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說明書進行逆轉錄反應，采用兩步法進行PCR擴增。擴增條件為: 95℃10 s; 95℃5 s，60℃30 s，循環50次; 95℃15 s，60℃1 h; 65℃30 s，循環61次。以PCR反應液作為空白對照，每組樣品設置3個復孔，以保證實驗數據的有效性和可靠性。所有引物均由英韋創津合成，實驗中所用的引物序列見表1。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primer used for real-time PCR

2.5Western blot實驗用裂解液提取細胞和組織中的總蛋白，蛋白定量后進行Western blot實驗。SDS-PAGE，轉膜，將PVDF膜置于5%的BSA封閉液中室溫封閉1 h后，TBST洗3次后加入I抗，4℃孵育過夜。用TBST洗膜后加入II抗室溫孵育1 h后。加入ECL發光液，曝光、顯影、定影。

2.6RNA干擾實驗按照Lipofectamine 2000說明書進行。換用OPTI-MEMI培養基后加入A液( 10 μL干擾序列+ 250 μL OPTI-MEMI培養基)和B液( 5 μL Lipofectamine 2000 + 250 μL OPTI-MEMI培養基)充分混勻，加無血清培養基至2 mL，置于培養箱轉染48 h后進行后續實驗。

3統計學處理

所有數據均以均數±標準差( mean±SD)表示，采用SPSS 13. 0統計軟件，以多組間單因素方差分析或t檢驗作統計學處理。以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1AngⅡ誘導的體外心肌細胞肥大模型的建立

采用100 nmol/L濃度的AngⅡ分別刺激心肌細胞6 h、12 h、24 h和48 h，檢測肥大相關因子心房鈉尿因子( atrial natriuretic factor，ANF)、腦鈉尿肽( brain natriuretic peptide，BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC) mRNA表達的變化。如圖1所示，在AngⅡ作用24 h后，心肌細胞中ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平顯著增加( P＜0. 05)，表明100 nmol/L濃度的AngⅡ刺激24 h可成功誘導心肌細胞肥大。

Figure 1.The effects of AngⅡ( 100 nmol/L) on the mRNA expression of ANF，BNP and β-MHC detected by realtime PCR.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs 0 h.圖1　AngⅡ誘導的心肌肥大模型中肥大基因表達的變化

2AngⅡ誘導心肌細胞肥大模型中PARP-2的mRNA和蛋白表達增加

以real-time PCR和Western blot方法分別檢測PARP-2的mRNA和蛋白水平變化。如圖2所示，不同濃度的AngⅡ( 0、1、10、100和1 000 nmol/L)分別處理24 h后，PARP-2的mRNA和蛋白表達隨AngⅡ濃度的增加而明顯增加( P＜0. 05)。選定100 nmol/ L的AngⅡ分別刺激心肌細胞6 h、12 h、24 h和48 h，檢測PARP-2的mRNA和蛋白表達隨時間增加而上升( P＜0. 05)，超過24 h時達到最高。這表明AngⅡ誘導的心肌細胞肥大模型中PARP-2的mRNA和蛋白表達明顯增加。

Figure 2.The expression of PARP-2 in neonatal rat cardiomyocytes treated with AngⅡ.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control ( 0 nmol/L or 0 h).圖2　AngⅡ誘導心肌細胞PARP-2 mRNA和蛋白的表達變化

3腹主動脈縮窄致大鼠心肌肥大模型的鑒定

對大鼠實施AAC手術從而建立心肌肥大模型，與假手術組比較，AAC模型組的IVSd、IVSs、LVPWd 及LVPWs等超聲心動參數均明顯增高( P＜0. 05)，LVIDs明顯下降( P＜0. 05)，見表2。而且心臟體積明顯增大提示AAC模型組大鼠發生明顯左室肥厚。

表2　各組大鼠超聲心動學參數Table 2.Echocardiographic parameters of sham and AAC rats ( Mean±SD.n =8)

將病理切片進行HE染色，檢測肥大相關因子ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平，與對照組相比均上升6～10倍，表明AAC術后大鼠心臟呈現典型的向心性肥厚，動物模型建立成功，見圖3。

4心肌肥大動物模型中PARP-2蛋白和mRNA的表達增加明顯

為明確PARP-2在心肌肥大動物模型中的變化情況，本實驗分別采用Western blot和real-time PCR法檢測PARP-2的蛋白表達和mRNA表達的變化，與假手術組比較，AAC模型的大鼠心臟中PARP-2的mRNA和蛋白的表達量顯著增加，見圖4。

5沉默PARP-2對心肌細胞肥大的影響

心肌細胞進行轉染48 h之后，分別采用realtime PCR和Western blot檢測PARP-2 mRNA和蛋白表達的變化。通過與正常對照( control，Con)組和陰性對照( negative control，Neg)組相比，si003干擾效率最高，達到80%以上，PARP-2的mRNA水平和蛋白水平均顯著下降，PARP-1蛋白表達無明顯變化，見圖5，表明干擾序列可特異性地沉默PARP-2。

利用si003序列對PARP-2進行沉默，然后分別通過real-time PCR和激光共聚焦顯微鏡來觀察ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平變化和心肌細胞表面積的變化。AngⅡ組和陰性對照組與空白對照組相比較心肌細胞表面積均明顯增加( P＜0. 05)，但是si003組與AngⅡ組相比心肌細胞表面積均明顯減小( P＜0. 05)。此外，AngⅡ組相對于空白對照組ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平顯著升高( P＜0. 05)，但是si003組與AngⅡ組相比ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平顯著下降( P＜0. 05)，與空白對照組水平一致，見圖5。這表明PARP-2基因沉默能夠逆轉AngⅡ所誘導的心肌細胞肥大。

Figure 3.A rat model of cardiac hypertrophy induced by abdominal aortic constriction ( AAC).Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05 vs sham.圖3　腹主動脈縮窄誘導大鼠心肌肥大模型的建立

Figure 4.PARP-2 mRNA and protein expression was up-regulated in abdominal aortic constriction rats.Mean±SD.n =8.*P＜0. 05 vs sham.圖4　AAC模型中PARP-2蛋白和mRNA表達的變化

討論

本研究中，我們首次發現在AngII誘導的體外和AAC誘導的體內心肌肥大的模型中，PARP-2的蛋白和mRNA水平均有明顯上升，且沉默PARP-2可以有效逆轉AngⅡ所誘導的心肌肥大，這些研究結果為利用PARP-2特異性抑制劑來治療和預防心肌肥大提供了初步的實驗依據，并為我們后續研究PARP-2介導心肌肥大的下游分子通路提供實驗基礎。

Figure 5.PARP-2 knockdown blocked the hypertrophic responses induced by AngⅡ.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs Con;#P＜0. 05 vs AngⅡ.圖5　沉默PARP-2后能夠逆轉AngⅡ所誘導的心肌細胞肥大

PARP家族重要成員之一的PARP-1與心血管疾病是關系密切，其抑制劑在心肌肥厚、心肌缺血及再灌注、動脈粥樣硬化等疾病中均有明顯作用，為臨床上開發其新型的抑制劑來治療心肌肥大等心血管疾病提供了證據。然而我們也知道PARP-1作為PARP家族最重要成員，其酶活性達到了整個家族的90% ～95%左右，在染色體的穩定，DNA損傷修復，基因轉錄，細胞的增長、死亡和凋亡等方面都有十分重要的生理作用［12］，因此單方面地將其完全抑制，所產生的副作用和不利方面也是不言而喻的。我們所研究的PARP-2在人體內大量存在于骨骼肌、中樞神經系統、心臟、肝臟、胰腺等組織器官中，其與PARP-1具有69%的同源性，而且晶體結構類似，可以相互作用，功能上互補，但不完全重合［10］。此外二者不同的DNA結合位點和蛋白靶點，決定了二者不同的生理功能。近年來，關于PARP-2特殊的生理功能越來越得到人們的廣泛關注。我們實驗結果中主要通過“功能缺失”( RNA干擾)的方法，闡明了PARP-2缺失可以有效逆轉AngⅡ所誘導的心肌肥大。由于PARP-2的酶活性只占了該家族酶活性的5%～10%，不會影響PARP家族正常的生理活性，因此開發特異性的PARP-2抑制劑對臨床治療心肌肥大有十分重要的意義。

目前對于新型的PARP-2選擇性抑制劑的研發得到人們的廣泛關注［12］。Moroni等［13］研究表明選擇性的PARP-2抑制劑UPF1069可以增加海馬切片中的細胞凋亡，但是可以保護缺血性腦損傷模型中的皮質細胞。因此UPF1069可以作為十分有用的工具開發PARP-2新的生物學功能，也可以用來區分其與PARP家族其它成員在細胞生長與凋亡等機制中的不同。越來越多的人們意識到PARP-2蛋白在DNA損傷修復、基因組的穩定以及炎癥方面的特殊作用以及PARP-2所參與的特定的分子信號途徑，為臨床研發其抑制劑提供了有力證據以及治療疾病的新的靶點。

我們的結果也同樣表明，用siRNA干擾序列特異性沉默PARP-2后能夠有效逆轉AngⅡ所誘導的心肌肥大，對開發選擇性的PARP-2抑制劑用于臨床治療心肌肥大提供一定的科學依據。

［參考文獻］

［1］Frey N，Katus HA，Olson EN，et al.Hypertrophy of the heart: a new therapeutic target?［J］.Circulation，2004，109( 13) : 1580-1589.

［2］鄒劍，周后先，先志偉，等.激活PPARα表達對AngII誘導的心肌肥大及核因子NFATc4/p65-NFκB相互作用的影響［J］.中國病理生理雜志，2014，30( 6) : 1017-1022.

［3］李瑞芳，樂康，高潔，等.抑制PPARα表達對ET-1誘導的心肌肥大和PI3K/Akt/GSK3β-NFATc4通路的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25( 12) : 2289-2294.

［4］Yélamos J，Schreiber V，Dantzer F.Toward specific functions of poly( ADP-ribose) polymerase-2［J］.Trends Mol Med，2008，14( 4) : 169-178.

［5］Ying W，Garnier P，Swanson RA.NAD+repletion prevents PARP-1-induced glycolytic blockade and cell death in cultured mouse astrocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，308( 4) : 809-813.

［6］Schreiber V，Dantzer F，Ame JC，et al.Poly( ADP-ribose) : novel functions for an old molecule［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2006，7( 7) : 517-528.

［7］Pacher P，Szabó C.Role of poly( ADP-ribose) polymerase 1 ( PARP-1) in cardiovascular diseases: the therapeutic potential of PARP inhibitors［J］.Cardiovasc Drug Rev，2007，25( 3) : 235-260.

［8］Bartha E，Solti I，Kereskai L，et al.PARP inhibition delays transition of hypertensive cardiopathy to heart failure in spontaneously hypertensive rats［J］.Cardiovasc Res，2009，83( 3) : 501-510.

［9］Pillai JB，Gupta M，Rajamohan SB，et al.Poly( ADP-ribose) polymerase-1-deficient mice are protected from angiotensin II-induced cardiac hypertrophy［J］.Am J Physiol Heart Circ Phy-siol，2006，291( 4) : H1545-H1553.

［10］Oliver AW，Amé JC，Roe SM，et al.Crystal structure of the catalytic fragment of murine poly( ADP-ribose) polymerase-2［J］.Nucleic Acids Res，2004，32 ( 2) : 456-464.

［11］Schreiber V，Amé JC，Dollé P，et al.Poly( ADP-ribose) polymerase-2 ( PARP-2) is required for efficient base excision DNA repair in association with PARP-1 and XRCC1 ［J］.J Biol Chem，2002，277( 25) : 23028-23036.

［12］Bartha E，Kiss GN，Kalman E，et al.Effect of L-2286，a poly( ADP-ribose) polymerase inhibitor and enalapril on myocardial remodeling and heart failure［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2008，52( 3) : 253-261.

［13］Moroni F，Formentini L，Gerace E，et al.Selective PARP-2 inhibitors increase apoptosis in hippocampal slices but protect cortical cells in models of post-ischaemic brain damage［J］.Br J Pharmacol，2009，157( 5) : 854-862.

Role of PARP-2 in cardiac hypertrophy in rats

ZHOU Guang-you1，GENG Biao1，GENG Tao1，AN Ru-feng1，TIAN Fang1，LIU Peiqing2
(1Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Taishan Medical University，Taian 271000，China;2Department of Pharmacology and Toxicology，School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China.E-mail: liupei_qing1964@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the expression of poly( ADP-ribose) polymerase-2 ( PARP-2) during rat cardiac hypertrophy in vitro and in vivo，and to explore the effects of PARP-2 on the cardiac hypertrophy.METHODS: Abdominal aortic coarctation ( AAC) was performed to establish a model of pressure overload-induced cardiac hypertrophy in SD rats.The expression of PARP-2 at mRNA and protein levels in the myocardium was determined by real-time PCR and Western blot.The hypertrophy model of the cardiomyocytes was induced by treating the cells with angiotensinⅡ( AngⅡ).PARP-2 was knocked down by siRNAs in neonatal rat cardiomyocytes and the cardiomyocyte hypertrophy was evaluated by measuring the mRNA levels of ANF，BNP，and β-MHC and the cellular surface area.RESULTS: The expression of PARP-2 at mRNA and protein levels was both increased in the AAC rats as compared with those in the sham animals.The expression of PARP-2 at mRNA and protein levels was also increased in a time-and concentration-dependent manner in AngⅡ-induced hypertrophy model of the cardiomyocytes.In the neonatal rat cardiomyocytes，knockdown of PARP-2 expression by siRNA attenuated AngⅡ-induced cardiac hypertrophy of the cardiomyocytes，indicating that endogenous PARP-2 played a positive regulatory role in cardiac hypertrophy.CONCLUSION: The mRNA and protein levels of PARP-2 increase in the in vitro and in vivo models of cardiac hypertrophy.Knockdown of PARP-2 protects cardiomyocytes from hypertrophy.

［KEY WORDS］Poly( ADP-ribose) polymerase-2; AngiotensinⅡ; Abdominal aortic coarctation; Cardiac hypertrophy

通訊作者△Tel: 020-39943116; E-mail: liupei_qing1964@163.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目( No.81072641; No.81273499)

［收稿日期］2015-01-23［修回日期］2015-04-13

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1153-07

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.001