外源NO對鎘脅迫下蓖麻亞細胞中鎘分布及抗氧化酶的影響

張晗芝

摘 要：重金屬的亞細胞分布及抗氧化酶系統是植物解毒的重要策略。一氧化氮（NO）是植物組織內重要的信號分子，在植物響應各種逆境條件發揮重要作用。該研究采用水培試驗，研究外源NO（SNP）對5 mg·kg-1 Cd脅迫下蓖麻中鎘的亞細胞分布及抗氧化酶活性的影響，探討NO調節下蓖麻對鎘的解毒機制。研究表明，與鎘處理下相比，100 μmol·L-1 SNP提高了金屬解毒組分，降低了金屬敏感組分；提高了過氧化氫酶（CAT）活性，不能明顯影響超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活性變化。因此，NO通過提高金屬解毒組分的含量和CAT活性，參與蓖麻對鎘的解毒作用。

關鍵詞：鎘 蓖麻 亞細胞 抗氧化酶 一氧化氮

中圖分類號：X173 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）12（a）-0157-03

重金屬在植物亞細胞的分布能夠反映植物的解毒機理（Wang和Rainbow，2006；Miao和Wang，2007）。采用差速離心法，組織細胞可分為5種亞細胞組分：金屬富集顆粒體、細胞碎屑、細胞器、熱敏感蛋白和熱穩定蛋白（Wallace等，2003）。重金屬脅迫下海洋硅藻、無脊椎動物和小麥等生物體的亞細胞區隔化已經開展過研究（Miao和Wang，2006；Wallace等，2003；Li等，2011）。

另外，抗氧化酶系統是植物抵抗鎘脅迫的一種解毒策略。鎘脅迫能夠誘導植物體內細胞的氧化脅迫，導致活性氧種類的增加，損害細胞組分（Sandalio等，2001）。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等抗氧化酶在清除活性氧方面發揮重要的作用，有效抵抗了重金屬毒性導致的氧化脅迫（Vanassche和Clijsters，1990；Chaoui等，1997）。而且，抗氧化酶活性水平能夠反映生物化學過程并預示金屬毒性（Li等，2011）。

蓖麻（Ricinus communis L.）是一種重要的能源作物，而且是潛在修復鎘污染農田的理想作物（Agarwal，2007；Huang，2011）。研究NO調節下蓖麻對鎘的解毒機制非常有意義。一氧化氮（NO）是植物體內一種生物活性分子，通過酶促和非酶促途徑產生，能緩解各種環境毒害（王芳等，2013）。

目前，關于外源NO（硝普鈉作為供體）對鎘脅迫下蓖麻中鎘的亞細胞分布及抗氧化酶活性影響研究還很少。本研究的目的：（1）探討外源NO影響下蓖麻中鎘的亞細胞分布特征；（2）研究外源NO影響下蓖麻抗氧化酶活性的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

該試驗為水培試驗，在溫室進行。溫室設定的溫度為晝夜25/15 ℃，光強度為300 mE/m2/s，16 h的光周期，平均相對濕度為65%。試驗采用50%霍格蘭營養液，組分包含2.5 mmol·L-1 KNO3，2.5 mmol·L-1 Ca（NO3）2，0.5 mmol·L-1 MgSO4，0.5 mmol·L-1 KH2PO4，25 μmol·L-1 H3BO3，2.25 μmol·L-1 MnCl2，0.15 μmol·L-1 CuSO4，1.9 μmol·L-1 ZnSO4，0.05 mmol·L-1（NH4）6Mo7O24和5 μmol·L-1 Fe-EDTA。選用的蓖麻品種Zibo-3由山東省淄博市農業科學院提供。蓖麻種子開始播種在無污染的人工土壤上生長2～3周，直到種苗具有兩片健壯的葉子。選擇長勢一致的蓖麻幼苗種植與含有400 mL營養液的1 L盆中。硝普鈉（SNP）的水溶液作為NO的供體，CdCl2 2.5 H2O的水溶液作為鎘污染來源。試驗設3個處理，分別為對照（CK）、5 mg·kg-1 Cd（Cd）、5 mg·kg-1 Cd+100 μmol·L-1 SNP（Cd+SNP），每個處理3個重復，蓖麻葉用于測定生理指標。營養液每三天更換一次，營養液的pH值保持在6.0±0.1。蓖麻幼苗在水培溶液中生長10天。

收獲的植物鮮葉先用自來水清洗，然后用超純水清洗3 遍，最后用吸水紙擦拭，保證無水分殘留。新鮮葉保存在液氮中，分析抗氧化酶、可溶性蛋白和亞細胞分布。

1.2 蓖麻葉中鎘的亞細胞分布

根據差速離心法（Zhang等，2015），細胞內的鎘可分離為5個亞細胞組分：金屬富集顆粒體、細胞碎屑、細胞器、熱敏感蛋白和熱穩定蛋白。5個亞細胞組分的鎘質量分數用火焰原子吸收光譜測定（Contra AA 700，Germany）。細胞器和熱敏感蛋白組分定義為金屬敏感組分，金屬富集顆粒體和熱穩定蛋白定義為生物解毒組分（Wang和Rainbow，2006）。數據為三個重復的平均值。

1.3 抗氧化酶和可溶性蛋白測定

新鮮的葉子（0.2 g）經過預冷的研磨器研磨達到均質化，由緩沖液提取。緩沖液的組分為：0.05 mmol·L-1的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉溶解于1%聚乙烯吡咯烷酮，調節 pH值為7.4。均勻的溶漿在10 000 g4 ℃的離心機中離心10 min（Li等，2011）。上清液用于可溶性蛋白和抗氧化酶活性的測定。蓖麻葉中可溶性蛋白的測定采用考馬斯亮藍的方法。可溶性蛋白的含量表示為mg protein·g -1。氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）的活性（Giannopolitis等，1977）。SOD活性以抑制NBT光還原反應50%所需的酶量為一個酶活性單位，表示為U/mg protein。過氧化氫酶（CAT）依據A240的變化速率計算CAT活性（Aebi，1984），以1 min內A240降低0.1為一個酶活性單位（U），表示為U/mg protein。過氧化物酶（POD）依據A470的變化速率計算POD活性（Chance等，1955），以1 min內A470降低1為一個酶活性單位（U），表示為U/mg protein。

1.4 統計分析

數據分析采用SPSS 16.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）的方差分析和T檢驗方法。所用指標采用三個重復。數據表示為平均值±誤差，用Duncans檢驗顯著性差異（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 蓖麻不同組織中鎘的亞細胞分布

以前研究發現，100 μmol·L-1 SNP+5 mg·kg-1Cd處理的生物量相比5 mg·kg-1鎘脅迫顯著增加，但明顯低于對照處理的生物量。另外，相對于鎘處理，添加100 μmol·L-1 SNP提高了蓖麻根部和地上部分鎘的富集能力。亞細胞中鎘的質量分數及相對含量（見表1）所示。相對于鎘處理，添加SNP處理細胞器和熱敏感蛋白中鎘質量分數分別顯著降低了65.6%和52.8%。添加SNP增加了生物解毒組分中鎘的質量分數和相對含量，降低了金屬敏感組分中鎘的質量分數和相對含量。

2.2 抗氧化酶活性

抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的活性（見表2）所示。相對于對照處理，5 mg·kg-1鎘處理條件下，SOD、CAT和POD的活性顯著降低；添加外源SNP后，CAT活性與Cd處理相比顯著提高，基本能恢復到對照水平，而SOD和CAT活性與Cd處理相比沒顯著差異。因此，添加SNP能通過調節CAT活性的方式緩解Cd脅迫下蓖麻葉中的氧化脅迫。

3 討論

生物體內金屬的亞細胞分布反應了金屬富集的內在過程，是一種能夠預測金屬毒性和耐性的方法（Wallace等，2003）。Wang和Wang（2008）研究認為金屬敏感組分能預測硅藻中鎘的毒性。Zhang等（2015）研究表明，蓖麻老葉中金屬解毒組分或者金屬敏感組分和蓖麻對鎘的耐性相關聯。該研究中SNP提高蓖麻對鎘耐性，可能與葉中金屬解毒組分增加和金屬敏感組分減少有關。

抗氧化酶（SOD、CAT和POD）是植物解毒機理的重要組成部分。SOD是一種金屬酶類，能夠催化超氧自由基轉化為過氧化氫和氧氣，保護細胞組分免受超氧自由基的毒害（Del Rio等，2002）。CAT和POD是調節細胞內過氧化氫含量的關鍵酶類（Blokhina等，2003）。研究發現，鎘脅迫下植物組織內抗氧化酶活性增加（Yu等，2013）。然而，該研究發現，5 mg·kg-1鎘脅迫下蓖麻葉中SOD、CAT和 POD活性顯著降低（Table 2）。Zhang等（2015）研究也發現，5 mg·kg-1或2 mg·kg-1鎘脅迫下蓖麻葉中SOD、CAT和POD活性降低或無明顯變化，與該研究結果相符。外源NO（SNP）能夠提高抗氧化酶（SOD、CAT和POD）活性，增強植物對鎘的毒害（王芳等，2013）。然而一些研究發現，SNP降低了SOD和POD的活性（朱涵毅等，2013），與該研究結果一致。該研究中SNP提高了蓖麻葉中CAT活性，參與蓖麻對鎘的解毒作用。因此，該研究發現，NO通過提高金屬解毒組分的含量和CAT活性，參與蓖麻對鎘的解毒作用。

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