哈爾濱地區新城疫病毒的分離鑒定及部分生物學特性研究

梁宏志（哈爾濱市動物衛生防疫站，哈爾濱　150016）

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哈爾濱地區新城疫病毒的分離鑒定及部分生物學特性研究

梁宏志
（哈爾濱市動物衛生防疫站，哈爾濱150016）

摘要：2012年4月～2014年4月，從哈爾濱市18個地區雞場中疑似新城疫（ND）發病雞群體內分離到6株具有血凝活性的病毒，經血凝試驗（HA）、血凝抑制試驗（HI）和電鏡觀察證實了6株病毒為新城疫病毒（NDV）。經蝕斑純化后進行生物學特性的研究顯示，其雞胚平均死亡時間（MDT）和1日齡雛雞腦內接種致病指數（ICPI）分別為37.2～60.8 h、1.71～1.80，說明該病毒屬于NDV強毒株或中強毒株。

關鍵詞：哈爾濱；新城疫病毒；分離鑒定；生物學特性

新城疫（ND），也叫亞洲雞瘟，是一種由副黏病毒引起的高度接觸性傳染病。哈爾濱地區養雞生產每年都有該病流行，病死率較高。近年來，盡管大劑量、多次使用弱毒疫苗和滅活疫苗，新城疫仍是養雞業一種常見病和多發病，新城疫病毒（NDV）在強大的免疫壓力下導致F基因發生變異，出現強毒株，給養雞生產帶來極大的危害。

本試驗以2012年4月～2014年4月從哈爾濱市18個地區、不同養殖條件下分離自雞體內的NDV作為研究對象，采用傳統的生物學特性鑒定方法對不同的NDV分離株進行致病力測定、生物學特性比較分析，旨在了解哈爾濱地區NDV的分布、毒力強弱及流行情況，同時也將為制定科學的ND防制措施提供參考依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病料來源

2012年4月～2014年4月，哈爾濱市動物衛生防疫站先后從哈爾濱市18個地區的196個養雞場采集的216份疑似NDV病料采集見表1，取病死雞腦、肝和腺胃等組織共分離得到6株雞源的NDV強度，分別命名為HRB1、HRB2、HRB3、HRB4、HRB5、HRB6。

表1　 216份疑似新城疫病毒病料采集

1.1.2參考毒株及陽性血清

NDV弱毒株LaSota及其陽性血清均購自于中國獸醫藥品監察所。

1.1.3試驗動物

9～12日齡無特定病原體（SPF）雞胚由中國農科院哈爾濱獸醫研究所SPF實驗動物中心購置。

1.1.4主要儀器

BECKMAN臺式離心機、超速離心機、超凈工作臺等。

1.1.5主要試劑

蝕斑純化試驗試劑包括胰酶、Hank's營養使用液、DMEM營養液、營養瓊脂糖、1%中性紅的配制等。

1.2試驗方法

1.2.1病毒的分離與增殖

采集病死雞的腦、肝、脾、肺和腺胃等組織，剪碎、研磨后加入滅菌生理鹽水配成1?4組織懸液，反復凍融3次，3 000 rpm離心20 min后，取上清液加雙抗保持濃度為1 000 U·mL-1，37℃作用2 h，然后進行溶液的細菌檢驗。細菌檢驗合格的樣品溶液取0.2 mL于10日齡的SPF雞胚的尿囊腔接種，去除接種后24 h內死亡雞胚，將48～96 h死亡的雞胚置4℃保鮮過夜后無菌采集雞胚尿囊液，然后觀察接種雞胚的病理變化情況，將該尿囊液稀釋1 000倍再進行1次雞胚接種，重復2次后收集尿囊液，進行血凝實驗（HA）和血凝抑制實驗（HI）實驗。

1.2.2血凝實驗和血凝抑制實驗

1%雞紅細胞懸液配制：用枸櫞酸鈉3.8%抗凝成年非免疫公雞血液，將采集的雞血按1?50加入生理鹽水，2 000 rpm，離心3～4 min，用吸管吸出上清液和沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，棄去。在沉淀的紅細胞上滴加稀釋液，充分混合，反復洗滌3次后加入生理鹽水配成1%濃度，4℃可保存7～ 10 d。

四單位抗原的配制：以能引起紅細胞100%凝集的病毒最高稀釋度作為終點，即1個HA單位，終點滴度除以4即為含4HA單位的抗原。例如：如果血凝的終點滴度為1?256，則4個血凝單位的應是1?64，此例中將1 mL抗原加入63 mL生理鹽水，即為4HA單位抗原。

HA實驗和HI實驗：按常規微量法（25 μL）（GB/ T 18936-2003）進行。

1.2.3電鏡觀察

取雞胚接種后采集的病毒尿囊液1 000 g，4℃離心10 min，取上清，磷鎢酸2%負染，透射電鏡下觀察拍照，電鏡由東北農業大學提供。

1.2.4毒株的統一命名規則

按照分離地區、毒株號、分離年代以及分離來源的動物種類命名見表2。

表2　各分離株的宿主和來源

1.2.5病毒的蝕斑純化

雞胚成纖維原代細胞的制備：取10日齡SPF雞胚無菌取出胚胎置于無菌平皿，用剪子將其剪碎，再用D-Hank'S液反復沖洗，后于組織沉淀物中加入胰酶0.25%，37℃溫度下消化，后棄去上層液體，再用D-Hank'S液反復洗滌，對其營養后用吸管充分吹打分散細胞，然后過濾除掉殘渣，按每個雞胚60 mL的量補加Hank's營養使用液，再充分吹打混勻，分置細胞培養瓶中37℃培養箱中培養。

雞胚成纖維繼代細胞的制備：將長成單層的原代成纖維細胞用0.25%胰酶消化，用DMEM配至6孔板中，37℃培養24 h，待細胞長成致密單層后備用。

單層蝕斑技術：反復洗滌細胞板，洗去死亡脫落細胞和殘余血清。以無血清的DMEM將待純化病毒的尿囊液做稀釋后取病毒懸液接種于單層細胞上，輕晃，使病毒與細胞充分接觸，吸附完畢后吸去病毒液，沖洗并除去未吸附病毒。之后鋪第一層不含中性紅的營養瓊脂糖，待瓊脂凝固后倒置培養于37℃CO2培養箱中。48 h后細胞出現病變時鋪第二層含中性紅的營養瓊脂糖培養基，凝固后，倒置于37℃培養箱中4～12h，待出現蝕斑后即可挑斑。

1.2.6蝕斑克隆化

根據病毒蝕斑的形態、大小選擇具有代表性的3個中等大小蝕斑作好標記，然后吸取蝕斑，放入無血清的DMEM培養液中，反復凍融3次，使病毒充分釋放，以此病毒懸液經適當稀釋后接種單層雞胚成纖維細胞，進行下一輪蝕斑。如此重復3次，一般即可達到純化目的。將最后一次純化的蝕斑毒反復凍融3次后接種于9～10日齡SPF雞胚，死后收獲尿素液經HA、HI實驗證實為NDV后，再進行后述試驗。

1.2.7最小致死量致死雞胚的平均死亡時間測定

將病毒尿囊液用無菌生理鹽水作連續的稀釋，每個稀釋度接種5枚SPF雞胚，每胚0.2 mL，同時設置5枚接種生理鹽水的雞胚做對照。37℃孵育，棄去24 h內死亡之雞胚，之后每隔2 h觀察1次，直至120 h。能夠使所有雞胚致死的病毒的最大稀釋倍數即為病毒的最小致死量（MLD），根據MLD各雞胚的平均死亡時間（MDT），MDT計算公式見式1。

1.2.8 1日齡雛雞腦內接種致病指數的測定

取HA滴度>24的病毒尿囊液經無菌檢驗后以滅菌生理鹽水做稀釋，每個毒株接種10只1日齡的SPF雛雞，腦內接種0.05 mL·只-1，同時設置10只注射生理鹽水對照組。所有雞均分組隔離飼養于負壓隔離器中，每日觀察1次，連續觀察8 d。每日觀察發病和死亡情況，死亡計2分，發病計1分，正常0分，腦內致病指數（ICPI）計算公式見式2。

2　結果與分析

2.1流行病學調查結果

2.1.1免疫情況

采集病料雞群中進行免疫所選擇ND疫苗的種類為：Ⅰ系、Lasota、C30-86、V4和B1，多數雞群采用點眼、滴鼻、飲水和注射等免疫途徑。

2.1.2臨床癥狀

產蛋雞發病的主要癥狀為食欲減退，排黃綠色稀便，不同程度的呼吸道癥狀，產蛋率下降10%～ 40%，出現白、軟皮蛋，病死率一般為5%～10%。有的雞群發病不表現明顯的臨床癥狀，只表現為過性的產蛋下降；有些育成雞發生癱瘓、斜頸、頭頸扭轉等神經癥狀，零星死亡，僅有個別發病雞群有較高死亡率。但部分病例，尤其是秋冬季和春季的商品肉雞或育雛雞的典型病例呈上升趨勢，其主要特點是死亡率較高（10%～30%），最高可達50%，需要與高致病性禽流感進行鑒別診斷。

2.1.3病理變化

臨床采集的病料病理剖檢變化均表現為眼結膜細沙樣出血，上呼吸道呈卡他性或出血性卡他性炎癥，喉頭和氣管黏膜充出血，胸腺腫大出血，腺胃乳頭出血（約占總病料數的30%），肌胃角質層下出血（約占總病料數的45%）；小腸黏膜呈“棗核樣潰瘍”變化（約占總病料數的18%），盲腸扁桃體新鮮出血，直腸末端及泄殖腔周邊新鮮出血；產蛋雞生殖系統一般表現卵泡充血、出血、液化、破裂。

2.2毒株的分離、血清學鑒定

將處理的病料接種雞胚后一般在28～60 h死亡，死胚全身出血，頭部、頸部、腹部和肢端出血嚴重，尿囊液清亮，不渾濁，HA滴度為16～ 128。初代培養物盲傳2代后死亡時間逐漸表現規律，血凝價可上升1～2個滴度。所有代次的NDV分離株尿囊液均可凝集1%的SPF雞紅細胞，HA為1?16～1?216；均可被NDV弱毒株（LaSota）陽性血清所抑制，HI分別為1?16～1?526，不被禽流感病毒（AIV）陽性血清所抑制。

2.3蝕斑純化結果

不同的NDV毒株在無胰酶的細胞培養物上形成蝕斑的能力、出斑時間、蝕斑的大小及形態均存在不同程度的差異。有的毒株在覆蓋第二層含中性紅的瓊脂糖后3～4 h就隱約可見蝕斑的出現，一般在感染后72～96 h各類蝕斑均明顯可見。試驗檢測的6個NDV分離毒株均能在單層雞胚成纖維細胞上形成無色透明的清亮型蝕斑。顯微鏡下觀察清亮蝕斑的中心有一些不著色的死細胞。蝕斑的形態多為圓形，也有一些呈不規則形，但均與正常細胞之間界限清楚，容易辯認。顯微鏡下NDV蝕斑形態見附圖。

附圖　顯微鏡下新城疫病毒蝕斑形態

2.4平均死亡時間測定結果

將6個NDV分離株以各自的最小致死量接種雞胚后，除接種生理鹽水對照組全部存活外，多數接種雞胚均在37～61 h內死亡，死亡時間較短，個別雞胚死亡時間為36 h。所有的死亡雞胚均可見到NDV典型的出血性病變，以頭、頸、肢體和翅端出血最嚴重，死亡雞胚均有血凝活性。不同毒株的MLD及MDT測定結果見表3。

表3　新城疫病毒分離株平均死亡時間測定結果

由表3可知，6株NDV分離株全為強毒株，依據MDT指數進一步分為速發型毒株（HRB2～6，MDT< 60 h）和中發型毒株（HRB1，MDT在60～90 h）。

2.5腦內致病指數測定結果

所有腦內接種NDV毒株的1日齡雛雞大多在3 d內死亡，而生理鹽水對照組在觀察8 d內全部正常。接毒雛雞主要癥狀表現為精神不振、呼吸困難、流黏涎、閉眼臥地不起、排黃綠色稀糞，個別表現典型神經癥狀，最后癱瘓死亡。個別發病死雞表現為喙發紺、眼部有分泌物、眼瞼黏連、嗉囊脹氣。NDV分離株ICPI測定結果見表4。

表4　新城疫病毒分離株腦內致病指數的結果

由表4可知，NDV分離株ICPI指數測定結果判定，6個NDV分離株中均為速發型毒株（ICPI值為1.6～2.0）。

3討論

3.1新城疫病毒生物學特性調查

NDV的HN蛋白與特定動物紅細胞表面的相應受體結合，可使雞紅細胞發生凝集，據此特性，再結合抗血清的特異性抑制作用所建立的HA和HI實驗已成為新城疫診斷的常規血清學方法。本研究在哈爾濱地區雞ND流行病學調查的基礎上，結合臨床癥狀、剖檢變化、HA和HI實驗，初步分離和鑒定了6株新城疫病毒。由于基層保存及運送條件的限制，有些送檢病料由于長時間暴露于外界環境中，導致病毒的毒力降低，因此將這些分離到的毒株經過除菌后接種SPF雞胚，不僅可以使毒株的毒力復壯，而且可以使這些毒株具有相同的增殖條件，增加了相互間的可比性。另外，哈爾濱地區的免疫雞群多發生非典型新城疫，即使經多次免疫仍然發生該病，為了排除疫苗毒株的干擾，在進行分離毒株的生物學特性研究之前，有必要對所分離的毒株進行純化。

目前，通用的NDV生物學特性研究指標主要有雞胚MLD的MDT、一日齡雛雞ICPI和6周齡雞靜脈接種致病指數（IVPI）三項指標。一般認為ND強毒株的MDT為30～60 h，ICPI≥1.6，接種雞表現為頭部水腫、下痢，在4～8 d內死亡，腸道有嚴重出血；中等毒力毒株MDT為60～90 h，ICPI為0.6～ 1.5，接種雞不表現強毒接種癥狀，只出現局部組織器官出血，少數發生共濟失調或麻痹；弱毒株MDT>90 h，ICPI<0.5，接種雞不發病、不死亡。本試驗的6個毒株經過MDT和ICPI測定結果表明，6個地區分離到的毒株全部為NDV強毒株。

3.2新城疫病毒分離物的蝕斑克隆與純化

目前，由于ND免疫接種的普及和流行毒株的廣泛存在，在臨床發病或死亡雞體內常可同時分離到多種疫苗毒株與自然野毒株。如果不進行分離株的純化而直接用于生物學研究，則容易造成結果的混亂，甚至產生假象。因此，采用將分離到的NDV提取物用蝕斑克隆法進行純化，選擇在疫病流行（或發病）過程中起主導作用的毒株作進一步的研究，結果發現，在無胰酶或鎂離子存在的情況下，低毒力NDV在細胞培養物中不能形成蝕斑，而強毒及中等毒力毒株可以形成蝕斑，因此很容易排除疫苗毒的干擾[ 1 ]。本試驗同時證明NDV分離物在無胰酶的細胞培養物上形成蝕斑的能力可在臨床的快速診斷上作為一種簡單的體外檢查NDV病毒毒力的方法。在蝕斑大小、形態與毒力的關系研究過程中，認為蝕斑的大小與毒力成正比，也就是說能形成大蝕斑的毒株是強毒株，但并非所有強毒株都能形成大蝕斑[ 2-7 ]。在本研究中所有6株NDV均能形成中蝕斑或大蝕斑。

4結論

本研究采集哈爾濱18個地區的196個代表性養殖場所提供的216份病料，分離出HRB1、HRB2、HRB3、HRB4、HRB5、HRB6共6株強毒株，表明哈爾濱地區雞群中存在ND強毒株。

研究發現，從很多非典型ND發病雞群中分離到的病毒是疫苗源的弱毒，而不是野外強毒感染造成。說明應用疫苗進行免疫接種，控制了ND的大規模流行，但由于哈爾濱地區各種雞場制定的免疫程序不統一、免疫方法不當以及各廠家疫苗質量參差不齊等多種因素的影響，導致雞群中ND免疫失敗，從而使哈爾濱地區出現大量的非典型ND。這種NDV流行的復雜性給哈爾濱地區養雞業ND的綜合防控造成很大困難。

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Isolation and Identification of Newcastle Disease Virus and Partial Biological Characteristics Research in Harbin Area

LIANG Hongzhi
（Animal Epidemic Prevention Station of Harbin, Harbin 150016, China）

Abstract:From April 2012 to April 2014, six viral strains which have hemagglutination activity were isolated from the chicken flocks with suspected newcastle disease (ND) in 18 regions of Harbin. Through the observation re?sults of the HI, HA test and electron microscopy, it was confirmed that these virus were the newcastle disease vrius (NDV). By the biological characteristics study in the plaque purified, it was found that the mean death time (MDT) of chicken embryos and 1 day old chicks intracerebral pathogenicity index (ICPI) were between 37.2～60.8 h and 1.71～ 1.80, which belongs to the virulent strains or velogenic and mesogenic strains of NDV.

Key words:Harbin; newcastle disease virus; isolation and identification; biological characteristics

作者簡介：梁宏志（1973-），遼寧興城人，碩士，高級畜牧師，主要從事動物疾病預防與控制。

收稿日期：2015-01-26

中圖分類號：S852.65

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0084（2015）04-0046-05