乳酸片球菌素Ped-A基因表達(dá)載體的構(gòu)建

穆熙軍，劉秀俠，許燕俠，孫學(xué)森，谷　巍（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安　271000）

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乳酸片球菌素Ped-A基因表達(dá)載體的構(gòu)建

穆熙軍，劉秀俠，許燕俠，孫學(xué)森，谷巍
（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

摘要：乳酸片球菌素可以作為防腐劑延長(zhǎng)食品的保鮮期，為研究和開發(fā)可食用級(jí)別的防腐劑，將乳酸片球菌素結(jié)構(gòu)基因Ped-A全長(zhǎng)和不含信號(hào)肽的序列克隆至乳酸菌表達(dá)載體pMG36e和pNZ8048，經(jīng)酶切鑒定及序列分析，所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α和DHB4中含有插入Ped-A基因全長(zhǎng)和不含信號(hào)肽的序列的重組質(zhì)粒。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了乳酸片球菌素Ped-A基因的乳酸菌表達(dá)載體pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）、pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）。

關(guān)鍵詞：乳酸片球菌素Ped-A；乳酸菌表達(dá)載體；構(gòu)建

抗生素作為飼料添加劑添加到畜禽日糧中能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率及防治疾病等，但飼用抗生素的負(fù)面影響受到越來越多的關(guān)注，例如耐藥性、殘留甚至可能危害到人類健康。益生素、酶制劑、酸化劑、抗菌肽等抗生素替代品成為當(dāng)今學(xué)者的研究熱點(diǎn)。抗菌肽來源于生物體本身，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、性能穩(wěn)定及較強(qiáng)的廣譜抗菌能力等特點(diǎn)，其作為飼料添加劑應(yīng)用于飼料中具有明顯的優(yōu)勢(shì)[1]。片球菌、鏈球菌、乳桿菌等屬的菌株在代謝過程中可以合成并分泌到環(huán)境中對(duì)致病菌以及腐敗菌具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽，即乳酸菌素[2]。鏈球菌產(chǎn)生的乳鏈菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抗性，因其理化性質(zhì)穩(wěn)定且無毒副作用，作為食品添加劑獲得FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合委員會(huì)的認(rèn)可[3]。與用于工業(yè)生產(chǎn)的乳鏈菌肽相比，乳酸片球菌來源的乳酸片球菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌也有抑菌活性，能有效殺死病原菌，尤其能抑制單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的生長(zhǎng)[4]。韓燁等將乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到pET-28a中，經(jīng)誘導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌有抗菌作用[5]。目前，已經(jīng)開發(fā)出商品化的乳酸片球菌素Ped-A，可延長(zhǎng)食品的保鮮期，并且能顯著抑制肉制品中李氏桿菌的生長(zhǎng)[6]。隨著世界人口的劇增，減少糧食損失與浪費(fèi)是提高全球糧食安全與實(shí)現(xiàn)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要體現(xiàn)。利用生物防腐劑和生物防治技術(shù)可以延長(zhǎng)食品、飲料或飼料的貯藏時(shí)間和安全性，并且不改變其感官特性[7]。本文將乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到乳酸菌表達(dá)載體，對(duì)今后利用重組乳酸菌表達(dá)、純化乳酸片球菌素，從而為獲得具有抑菌活性的乳酸片球菌素提供了參考依據(jù)，為乳酸片球菌素作為防腐劑的開發(fā)奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α為TaKaRa公司產(chǎn)品，大腸桿菌DHB4為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)王曉云教授惠贈(zèng)；pMG36e和pNZ8048為山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院基因工程研究室保存；dNTP、EasyTaq DNA聚合酶、EasyPfu DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ購(gòu)自TaKaRa公司；DL2000 DNA Mark?er、DL5000 DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 Ped-A基因合成

根據(jù)NCBI公布的基因序列，將乳酸片球菌素Ped-A基因全長(zhǎng)（189 bp）及不含信號(hào)肽的序列（135 bp）上下游分別添加XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，委托TaKaRa公司合成，同時(shí)根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物PED1、PED2、PED3，引物PED1/PED3對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)基因，引物PED2/ PED3對(duì)應(yīng)于不含信號(hào)肽的序列。根據(jù)載體pMG36e、pNZ8048序列分別設(shè)計(jì)引物PMG1/ PMG2、PNZ1/ PNZ2，各引物序列見表1，均由濟(jì)南博尚公司合成。

表1　引物序列

將TaKaRa合成產(chǎn)物pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）活化培養(yǎng)后收集菌液，提取質(zhì)粒，使用XbaⅠ和HindⅢ分別進(jìn)行單酶切、雙酶初步鑒定。DNA序列分析由濟(jì)南博尚公司完成（使用pMD18-T載體通用測(cè)序引物），使用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與理論序列比對(duì)。

1.2.2重組質(zhì)粒pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）和pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）的構(gòu)建

1.2.2.1酶切、連接和轉(zhuǎn)化

提取pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）、pMG36e和pNZ8048質(zhì)粒，均用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，膠回收后，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）和pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）分別轉(zhuǎn)化DH5α和DHB4感受態(tài)細(xì)胞，加連接產(chǎn)物5 μL與感受態(tài)細(xì)胞50 μL混合，冰浴30 min，42℃熱激60 s，加LB培養(yǎng)基900 μL，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，8 000 rpm離心收集菌體2 min，棄部分上清，懸浮菌體，取全部菌液涂LB平板（分別添加紅霉素200 μg·mL-1和氯霉素7.5 μg·mL-1）。

1.2.2.2陽(yáng)性克隆的篩選

菌液PCR篩選pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）陽(yáng)性克隆，所用引物為載體引物PMG1/PMG2。PCR條件為94℃，5 min；94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min 20 s（擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)）；72℃，6 min。

菌液PCR篩選pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）陽(yáng)性克隆，所用引物為載體引物PNZ1/ PNZ2。PCR條件為94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1 min 40 s（擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)）；72℃，5 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定及DNA序列分析

選取篩選出的陽(yáng)性重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，使用XbaⅠ和HindⅢ酶切初步鑒定重組子。將提取出的重組質(zhì)粒pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）和pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）送濟(jì)南博尚公司測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1 pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）酶切鑒定及測(cè)序

pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）XbaⅠ和HindⅢ酶切鑒定電泳圖見圖1，PMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）XbaⅠ和HindⅢ雙切酶鑒定電泳圖見圖2。

將TaKaRa合成產(chǎn)物活化培養(yǎng)后收集菌液，提取質(zhì)粒，使用XbaⅠ和HindⅢ分別進(jìn)行單酶切及雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖1、2。單酶切后所得片段的大小約3 kb，與理論值一致；雙酶切結(jié)果中，目的基因條帶大小合適。將TaKaRa公司合成產(chǎn)物pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）送濟(jì)南博尚公司測(cè)序（使用pMD18-T載體通用測(cè)序引物），測(cè)序結(jié)果顯示，合成的序列完全正確。

圖1　 pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）XbaⅠ和HindⅢ酶切鑒定電泳圖

2.2重組質(zhì)粒pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）陽(yáng)性克隆的菌液PCR篩選結(jié)果

pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）菌液PCR（引物PMG1/PMG2）篩選電泳圖見圖3。

使用T4DNA連接酶將回收的目的基因與載體片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α。使用載體引物PMG1/PMG2進(jìn)行菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，產(chǎn)物用1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3，所得目的條帶大小正確，篩選到多個(gè)陽(yáng)性克隆。

圖2　 pMD18-T/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）XbaⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定電泳圖

圖3　 pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）菌液PCR（引物PMG1/PMG2）篩選電泳圖

2.3重組質(zhì)粒pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）的酶切鑒定及測(cè)序

pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）重組質(zhì)粒電泳圖見圖4。

圖4　 pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）重組質(zhì)粒電泳圖

使用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，電泳檢測(cè)，質(zhì)粒大小正確，見圖4；37℃條件下使用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切3 h后電泳檢測(cè)，在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶，表明pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）構(gòu)建成功，結(jié)果見圖5。將重組質(zhì)粒送濟(jì)南博尚公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)表達(dá)載體pMG36e/ Ped-A（全長(zhǎng)/片段）構(gòu)建成功。

2.4重組質(zhì)粒pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）陽(yáng)性克隆的菌液PCR篩選結(jié)果

pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)）菌液PCR篩選電泳圖見圖6。pNZ8048/Ped-A（片段）菌液PCR篩選電泳圖見圖7。

使用T4DNA Ligase將回收的目的基因與載體片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DHB4，使用載體引物PNZ1/PNZ2進(jìn)行菌液PCR篩選，擴(kuò)增產(chǎn)物用1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖6、7，由圖可以看出，成功篩選到多個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

2.5重組質(zhì)粒pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）酶切鑒定

重組質(zhì)粒pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）電泳圖見圖8。重組質(zhì)粒pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）酶切鑒定電泳圖見圖9。

使用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，電泳檢測(cè)，如圖8所示；37℃條件下使用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切3.5 h后電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖9。將提取出的重組質(zhì)粒送濟(jì)南博尚公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)表達(dá)載體pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）構(gòu)建成功。

圖5　 pMG36e/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）重組質(zhì)粒電泳圖

圖6　 pNZ8048/Ped-A全長(zhǎng)的菌液PCR篩選電泳圖

圖7　 pNZ8048/Ped-A（片段）菌液PCR篩選電泳圖

圖8　重組質(zhì)粒pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）電泳圖

圖9　重組質(zhì)粒pNZ8048/Ped-A（全長(zhǎng)/片段）酶切鑒定電泳圖

3　討論

在食物及飼料保存中，傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑可以解決由微生物引起的腐敗和疾病，但防腐劑的濫用又造成了一系列的安全問題。乳酸片球菌素具有天然安全、無毒副作用及耐熱耐酸的特性，因而作為可食用級(jí)別防腐劑具有良好的應(yīng)用前景[8]。野生乳酸片球菌素產(chǎn)量低、分離純化技術(shù)不成熟，純化產(chǎn)物得率和純度不能兩全，這些問題是乳酸片球菌素實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸[9]。近些年大量研究嘗試?yán)玫鞍踪|(zhì)工程、基因工程方法獲得更高活性的細(xì)菌素[10]。異源表達(dá)可以提高乳酸片球菌素的產(chǎn)量，目前多用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母菌表達(dá)系統(tǒng)和乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)片球菌素[11-12]。雖然以大腸桿菌為宿主可以實(shí)現(xiàn)乳酸片球菌素的高效表達(dá)和具有易于純化的特點(diǎn)，但將其表達(dá)的乳酸片球菌素作為食品級(jí)防腐劑獲得許可并推廣應(yīng)用存在爭(zhēng)議。乳酸菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的常見細(xì)菌，因其不具有致病性，被公認(rèn)為安全級(jí)微生物，并且在青貯飼料發(fā)酵中起主要作用，是一類數(shù)量和種類最多的微生物。因此，利用乳酸菌作為片球菌素異源高效表達(dá)的宿主表達(dá)菌成為具有前景的選擇。

4　結(jié)論

本研究將Ped-A基因成功克隆到乳酸菌表達(dá)載體pNZ8048和pMG36e，積累了乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建，為食品級(jí)乳酸菌高效表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)利用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Construction of Expression Vectors for Lactic Acid Pediocin Ped-A

MU Xijun, LIU Xiuxia, XU Yanxia, SUN Xuesen, GU Wei
（Shandong Baolai-Leelai Bio-Industrial Co., Ltd., Taian 271000, Shandong China）

Abstract:Lactic acid pediocin can be used as a preservative to extend the shelf life of food. The full gene se?quence of Ped-Aand without signal peptide were inserted into expression vectors pMG36e and pNZ8048. By using re?striction enzyme and sequence analysis, it can be proved that recombinant plasmids pMG36e/Ped-A(full length/ frag?ment) and pNZ8048/Ped-A(full length / fragment) were transformed into E. coli DH5α and DHB4 successfully. The result confirmed that Ped-Agene expressionvectors were constructed successfully.

Key words:pediocin Ped-Agene; lactobacillus expression vector; construction

作者簡(jiǎn)介：穆熙軍（1982-），男，山東泰安人，碩士，助理研究員，主要從事基因工程技術(shù)在微生態(tài)制劑應(yīng)用的研究。

收稿日期：2014-10-05

中圖分類號(hào)：TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0084（2015）02-0001-05