α-突觸核蛋白通過(guò)氨基端引起MN9D細(xì)胞線粒體膜損傷

高 歌，申甲梅，段春禮，王 雪，魯玲玲，張建亮，楊 慧

(首都醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)生物系 北京腦重大疾病研究院 帕金森病研究所 北京市神經(jīng)再生修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069)

帕金森病(Parkinson's Disease，PD)是第二大神經(jīng)退行性疾病，PD的發(fā)病因素涉及基因、環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)毒素和老化等多種因素。這些致病因素中線粒體功能障礙是PD 致病的中心環(huán)節(jié)[1]。Α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)是首個(gè)被報(bào)道的PD 致病基因，因此深入研究α-syn 對(duì)線粒體功能的影響，對(duì)PD的發(fā)生發(fā)展及治療都有重要意義。目前雖然α-syn 被分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N端，NAC區(qū)及C端，但α-syn 各結(jié)構(gòu)域的具體作用仍不清楚。本研究將探討過(guò)表達(dá)α-syn的各結(jié)構(gòu)域?qū)?xì)胞及線粒體的影響，進(jìn)而為闡明PD 發(fā)病的可能機(jī)制及發(fā)現(xiàn)治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠多巴胺能細(xì)胞系(MN9D細(xì)胞)(Novartis公司Bastian Hengerer 博士惠贈(zèng))，人胚腎細(xì)胞株(HEK293)，DMEM/F12 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco 公司)，胰蛋白酶、JC-1(5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-甲基苯并咪唑氫碘化物)和DCFH-DA(2'，7'-二氯熒光素-二酯)，(Sigma 公司)，MitoProbeTMTransition Pore Assay Kit (Invitrogen 公司)，人源α-syn(α-syn蛋白全長(zhǎng))，α-syn/N(α-syn 氨基端)，α-syn/delN (α-syn 去氨基端)，α-syn/NAC(NAC區(qū))，α-syn/C(羧基端)，α-syn/delC(去羧基端)質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:用含有10% 胎牛血清(FBS)、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)MN9D細(xì)胞，用含10% FBS，100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，于37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組:未處理組(control)，空載體組(Myc)，α-syn 過(guò)表達(dá)組(α-syn)，α-syn/N 過(guò)表達(dá)組(α-syn/N)，α-syn/delN 過(guò)表 達(dá)組(α-syn/delN)，α-syn/NAC過(guò)表達(dá)組(α-syn/NAC)，α-syn/C過(guò)表達(dá)組(α-syn/C)，α-syn/delC過(guò)表達(dá)組(α-syn/delC)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)間48 h。按照Lipofectamine2000 操作說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力:上述各組MN9D細(xì)胞用100 μL 培養(yǎng)基按1×105個(gè)/孔接種于96孔板，每組細(xì)胞接種8個(gè)復(fù)孔。……