中藥藤莓湯對Ⅱ型膠原誘導性大鼠關節炎性病理損傷的影響

2015-05-11 11:13:53王亞南馬衛國張繼勝李慧慧林子超沈志明孟鳳仙

中國比較醫學雜志 2015年4期

關鍵詞：中藥劑量模型

陸妍，王亞南，劉慧，馬衛國，張繼勝，譚玲，李慧慧，林子超，沈志明，王潔，孟鳳仙

（1.北京中醫藥大學東方醫院風濕科，北京 100078；2.昌平區中西醫結合醫院腦病科，北京 102208；3.密云縣中醫院風濕科，北京 101500）

中藥藤莓湯對Ⅱ型膠原誘導性大鼠關節炎性病理損傷的影響

陸妍1，王亞南1，劉慧1，馬衛國1，張繼勝1，譚玲2，李慧慧3，林子超1，沈志明1，王潔1，孟鳳仙1

（1.北京中醫藥大學東方醫院風濕科，北京 100078；2.昌平區中西醫結合醫院腦病科，北京 102208；3.密云縣中醫院風濕科，北京 101500）

目的探討中藥藤莓湯對Ⅱ型膠原誘導性關節炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠關節滑膜炎癥指數、四肢腫脹程度、關節組織炎性浸潤的改善情況，以及免疫炎性相關因子影響。方法建立CIA模型，將造模成功的SD大鼠隨機分為模型組、陽性藥組、中藥大、小劑量組，設正常對照組，每組6只，干預治療12周。每周使用游標卡尺測量四肢踝腕部前后徑、左右徑，爪掌足墊厚度，以及雙后肢的跖關節腫脹最高點寬度，評價其關節積分和四肢腫脹程度。結果 ①與正常組比較，模型組大鼠關節炎總AI評分及雙后肢AI評分顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；左前肢AI評分在10-12周時升高（P＜0.05）；左后肢前后徑、左右徑、足墊厚度及左后肢跖骨最高點測量值在1-12 w不同時間段增加（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，中藥大、小劑量組總AI評分及左后肢關節AI評分在6 w后降低（P＜0.05）；陽性藥組10-12 w時左前肢AI評分下降（P＜0.05）。②與正常組比較，模型組IL-6、TNF-α mRNA轉錄及蛋白表達水平顯著上調（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組、中藥大、小劑量組IL-6、TNF-α mRNA轉錄及蛋白表達水平顯著下調（P＜0.01）。③光鏡檢測結果顯示：中藥小劑量組明顯改善了CIA模型大鼠關節滑膜增生、炎性細胞浸潤情況。結論中藥藤莓湯改善CIA模型大鼠關節病理損傷的分子機制可能與其抑制滑膜組織免疫炎性因子高表達相關。

中藥藤莓湯；CIA模型；AI積分；病理改變；免疫炎性機制

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關節滑膜慢性炎癥為主要表現的高致殘性、炎癥性自身免疫性疾病，最終導致關節畸形和功能喪失。因此，尋找靶向治療對策，是目前國際醫學領域研究的熱點。本實驗采用牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑聯合應用建立CIA大鼠模型，通過對大鼠一般情況觀察、體重分析、四肢關節AI積分評價、四肢腫脹程度的分析、關節組織病理學檢測，以及相關炎性因子的檢測，討論有良好臨床療效基礎的中藥藤莓湯對CIA模型大鼠的關節滑膜免疫炎性病理損傷的改善及分子機制，探討中醫藥治療RA的作用環節。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和實驗環境

SPF級雄性SD大鼠90只，體重（200～220）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001）。北京中醫藥大學動物實驗室實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2011-0024。

1.2 儀器與試劑

試劑：牛源性Ⅱ型膠原蛋白（bovine type II collagen，CII），購自Chondre公司（Lot130087）；完全弗氏佐劑（Freund’s complete adjuvant，FCA），購自Sigma公司（CAS 9007-81-2）；大鼠 IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自eBioscience公司；Trizol提取總RNA試劑為Invitrogen公司產品，批號：66007；One Step SYBR RT-PCR Kit為Takara公司產品，批號：BK1401；GAPDH、目標基因上下游引物均為美國invitrogen（上海）英駿生物技術有限公司合成。儀器：Applied Biosystems 7500型定量PCR儀，美國應用生物系統（ABI）公司；TC-96/G/H（b）梯度PCR儀，博日科技有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機，中科中佳公司；RT-6000型酶標儀，深圳雷杜公司產品；超凈工作臺（SW-CJ-IFD）。

1.3 實驗藥物

中藥藤莓湯（忍冬藤30 g，蛇莓15 g，烏蛇10 g，白芥子10 g，乳香10 g，沒藥10 g，桑枝30 g，穿山龍30 g等），由北京中醫藥大學東方醫院藥劑科制劑室提供。來氟米特片（蘇州長征-欣凱制藥有限公司，國藥準字H20000550）。

1.4 造模及分組

1.4.1 牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑混合乳劑的配制（濃度為1 mg/mL）：取114 μL冰醋酸放置于50 mL離心管，加20 mL滅菌注射用水，配成0.1 mol/L冰醋酸溶液，4℃冰箱降溫。將15 mL醋酸加入30 mg C II凍粉中使膠原完全溶解，4℃避光過夜。次日取已配制好的牛C II冰醋酸溶液及FCA各15 mL，用自制乳化器（輸液器膠管連接2個注射器）在冰浴條件下將其完全乳化。4℃避光儲存備用。

1.4.2 造模方法：初次免疫時（0 d），于造模組大鼠尾根部皮內注射200 μL C和FCA的混合乳劑（含C II 200 μg）。加強免疫時（初次免疫后第9天），于大鼠尾根部皮內注射100 μL C II和FCA的混合乳劑（含C II 100 μg），正常對照組注射等體積的生理鹽水。16 d（初次免疫后1周）時對CIA大鼠模型進行評價，用游標卡尺測量腫脹部位具體數值以平價四肢腫脹程度，進行關節AI評分。

1.4.3 模型評價標準［1，2］及成模數量：關節炎模型評價標準：0分，正常。1分，明顯可見的腕/踝關節輕度腫脹或局限于單個關節腫脹或少數幾個關節受累。2分，中度的腕/踝關節腫脹，僅局限于單個腕/踝關節，不累及其他指間關節。3分，嚴重的腕/踝關節腫脹，累及足爪（足背及掌指/跖趾關節）。4分，整個肢體腫脹累及多個關節。AI評分≥4分者視為模型成功。本實驗84只造模組大鼠中70只模型成功，成模率為83.3％。

1.4.4 實驗分組：隨機抽取造模成功大鼠30只，分為模型組，陽性藥物組，中藥大劑量組，中藥小劑量組，每組各6只，另設正常對照組6只。

1.5 干預方法

正常組與模型組予蒸餾水10 mL/kg﹒d灌胃。陽性藥組予來氟米特灌胃，劑量為1.87 mL/kg﹒d。中藥大劑量組按照生藥量31.8 mL/kg﹒d灌胃給藥。中藥小劑量組按照生藥量15.9 mL/kg﹒d灌胃給藥。各藥物組中藥量相當于臨床常人等公斤體重用量的5.6倍。干預治療12周。

1.6 觀察指標

1.6.1 CIA模型大鼠關節炎指數（Arthritis index，AI）變化：干預治療后每周進行AI評分，觀察關節炎指數變化情況。

1.6.2 CIA模型大鼠四肢腫脹程度的改善情況：使用游標卡尺測量大鼠雙前肢足墊厚度，腕橫紋部與掌面垂直的厚度（前后徑），腕橫紋部尺橈外點的厚度（左右徑），雙后肢的足墊厚度，踝的背部橫紋到足跟處的厚度（前后徑），踝部內外側高點的厚度（左右徑）。為了更好地評估關節腫脹程度，加設了跖骨腫脹最高的部分垂直足墊的厚度（跖骨高點）。

1.6.3 CIA模型大鼠滑膜組織相關炎性因子的檢測：1.6.3.1 RT-PCR技術檢測CIA模型大鼠滑膜組織IL-6、TNF-αmRNA轉錄水平：取CIA模型大鼠關節滑膜組織，使用Trizol試劑提取RNA后，進行一步法RT-PCR反應，檢測TNF-α、IL-6水平。反應體積為25 μL，反應體系含樣本RNA 2 μL，10 pmol引物各0.8 μL。TNF-α、IL-6基因序列：針對TNF-α基因序列的上下游引物分別是：5-GGATCTCAAAGA CAACCAAC-3和5-ACAGAGCAATGACTCCAAAG-3；針對 IL-6基因序列的上下游引物分別是：5-CCCTGACTGGCTAAAGGACA-3和5-CAGTACAGCC GCCTTCT AGG-3；針對看家基因GAPDH基因序列的引物分別是：5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3和5-TTTA ATGTCACGCACGATTTC-3。擴增條件為：42℃滅活5 min，95℃變性10 s，95℃ 退火5 s，60℃延伸34 s，共40個循環。反應結束后進行熔解曲線分析，以鑒定PCR產物的特異性。使用SDS軟件分析 RT-PCR過程各檢測樣本的 Ct（threshold of cycle）值。

1.6.3.2 ELISA技術檢測CIA模型大鼠關節滑膜組織IL-6、TNF-α蛋白表達水平：取出試劑盒，按按試劑盒說明操作。用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光值，陽性反應的最大稀釋度為待測樣品的效價。1.6.4 CIA模型大鼠右踝關節組織病理學變化：干預治療12周后，觀察各組大鼠右踝關節的病理學變化。將固定好的右踝關節取材、脫鈣后，流水沖洗數小時，經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，4 μm切片，進行HE染色，光鏡觀察關節滑膜被覆上皮有無變性、增生，間質有無炎細胞浸潤及肉芽組織形成；關節周圍軟組織有無炎細胞浸潤或纖維化。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 中藥藤莓湯對CIA模型大鼠關節AI積分的影響

2.1.1 大鼠關節總AI積分變化：與正常組比較，模型組大鼠關節總AI積分在0～12周顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組在10周時關節總AI積分明顯降低，具有顯著差異（P＜0.01）；中藥大劑量組在6周～11周時AI分值明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；中藥小劑量組在6周、8周、9周、10周時關節總AI積分降低（P＜0.05或P＜0.01）（表1）。

2.1.2 大鼠左前肢及左后肢AI積分變化：與正常組比較，模型組左前肢AI積分10周-12周時明顯升高（P＜0.05）。左后肢AI積分在1周～11周時升高，有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組左前肢AI積分10周-12周顯著降低（P＜0.05）；左后肢AI積分在10周時明顯下降（P＜0.01）。中藥大劑量組左前肢AI積分在10周～12周顯著降低（P＜0.05）；左后肢AI積分6周～11周時下降（P＜0.05或P＜0.01）；中藥小劑量組左后肢AI積分6周、8周～11周時降低（P＜0.01）（表2，3）。

表1 各組大鼠關節總AI變化（±s，n=6）Tab.1 Changes of arthritis indexes in the rats of all groups（±s n=6）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01Note.Compared with the normal group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with the model group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周Groups正常組0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00± Normal group0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00模型組7.17±8.33±8.50±8.67±8.50±5.17±8.50±9.33±9.17±9.17±9.33±9.83±7.17± Model group1.33##0.82##0.84##1.21##0.84##4.31#1.76##2.07##2.04##2.40##2.07##3.49#3.37#陽性藥組7.67±7.50±7.50±7.50±8.00±3.00±6.33±4.67±6.50±5.67±3.67±4.50±3.67± Positive group1.972.172.671.761.793.352.072.731.982.341.51＊＊3.021.51中藥大劑量組7.50±8.33±8.33±7.17±7.00±5.00±3.00±2.67±1.00±1.50±2.33±1.67±1.83± High-dose group2.351.511.972.231.673.291.10＊＊2.07＊＊1.67＊＊△△1.98＊＊0.82＊＊0.82*2.23中藥中劑量組7.00±9.00±8.00±5.67±6.00±3.33±2.67±3.00±1.67±1.83±2.67±3.17±2.00± Low-dose group1.673.524.204.083.105.321.63＊＊3.522.25＊＊△2.23＊＊2.73*2.563.03

表2 各組大鼠左前肢AI變化（±s，n=6）Tab.1 Changes of arthritis indexes of the left forelimb of rats in all groups（±s，n=6）

組別0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周Groups正常組0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00± Normal group0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00模型組0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.67±0.67±0.67±0.50±0.50±1.00±1.33±1.00± Model group0.000.000.000.000.001.631.631.630.840.841.67#2.07#1.67#陽性藥組0.00±0.00±0.17±0.17±0.33±0.00±0.17±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00± Positive group0.000.000.410.410.520.000.410.000.000.000.00*0.00*0.00*中藥大劑量組0.50±0.67±0.83±0.67±0.33±0.17±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00± High-dose group1.231.031.331.030.820.410.000.000.000.000.00*0.00*0.00*中藥小劑量組0.00±0.67±0.67±0.50±0.33±0.83±0.00±0.00±0.33±0.33±0.33±0.33±0.33± Low-dose group0.001.631.631.230.821.330.000.000.820.820.820.820.82

表3 各組大鼠左后肢AI變化（±s，n=6）Tab.3 Changes of arthritis indexes of the left hind limb in rats of all groups（±s，n=6）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：Compared with the normal group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with the model group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周Groups正常組0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00±0.00± Normal group0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00模型組3.17±4.00±4.00±4.00±4.00±2.17±3.83±4.00±4.00±4.00±4.00±3.83±2.83± Model group1.330.00##0.00##0.00##0.00##1.72#0.41##0.00##0.00##0.00##0.00##0.41##0.75陽性藥組4.00±3.83±3.67±3.50±3.83±1.33±3.33±2.33±3.33±3.00±2.00±2.17±2.00± Positive group0.000.410.520.550.411.750.521.370.820.890.63＊＊1.470.63中藥大劑量組3.17±3.83±3.83±3.33±3.33±2.33±1.50±1.33±0.50±0.83±1.17±0.83±0.83± High-dose group1.600.410.410.820.521.510.55＊＊△△1.03*0.84＊＊△△0.98＊＊△0.41＊＊0.41＊＊0.75中藥小劑量組3.50±3.83±3.33±2.33±2.67±1.00±1.33±1.50±0.33±0.50±1.00±1.17±0.67± Low-dose group0.840.410.820.820.821.550.82＊＊△1.760.52＊＊△△0.55＊＊△△0.63＊＊0.75＊＊0.82

2.1.3 大鼠右前肢及右后肢AI積分變化：與正常組比較，模型組大鼠右前肢AI積分在0～12周時無明顯統計學意義（P＞0.05）右后肢AI積分在0～12周顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組右后肢AI評分在10周時明顯下降（P＜0.05）；中藥大劑量組在6～12周時右后肢AI積分下降（P＜0.05或P＜0.01）；中藥小劑量組6周、8～12周右后肢AI積分降低，差異有統計學意義（P＜0.01）（表4，5）。

2.2 中藥藤莓湯對CIA模型大鼠雙后肢腫脹程度的改善

2.2.1 左后肢前后徑、左右徑變化情況：與正常組比較，模型組大鼠左后肢前后徑測量值在2周、3周、6周、8周、10～12周時明顯增加（P＜0.05）；左后肢左右徑測量值在1～4周，6～12周時顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，中藥大劑量組12周時左后肢前后徑測量值下降（P＜0.05）；中藥小組12周時左后肢前后徑、左右徑測量值降低（P＜0.05）。見表6，7。

表4 各組大鼠右前肢AI變化（±s，n=6）Tab.4 Changes of arthritis indexes of the right forelimb in rats of all groups（±s，n=6）

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周正常組Normal group（6）0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00模型組Model group（6）0.00± 0.00 0.33± 0.82 0.50± 0.84 0.67± 1.21 0.50± 0.84 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.67± 1.63 0.67± 1.63 0.67± 1.63 0.33± 0.82 0.67± 1.63 0.33± 0.82陽性藥組Positive groupgroup（6）0.33± 0.82 0.50± 0.84 0.50± 0.84 0.83± 0.98 0.50± 0.84 0.17± 0.41 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00中藥大劑量組High-dose group（6）0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.17± 0.41 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.33± 0.82中藥小劑量組Low-dose group（6）0.00± 0.00 0.67± 1.63 0.67± 1.63 0.50± 1.23 0.33± 0.82 0.50± 1.23 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.33± 0.82 0.33± 0.82 0.33± 0.82 0.33± 0.82 0.33± 0.82

表5 各組大鼠右后肢AI變化（±s，n=6）Tab.5 Changes of arthritis indexes of the right hind limb in rats of all groups（±s，n=6）

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周正常組Normal group 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00 0.00± 0.00模型組Model group 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 2.33± 1.51# 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 4.00± 0.00## 3.00± 0.63##陽性藥組Positive group 3.33± 1.63 3.17± 1.60 3.17± 1.60 3.00± 1.55 3.33± 1.21 1.50± 1.64 2.83± 1.47 2.33± 1.37 3.00± 1.55 2.67± 1.51 1.67± 1.03* 2.33± 1.63 1.67± 1.03中藥大劑量組High-dose group（6）3.83± 0.41 3.83± 0.41 3.50± 0.55 3.17± 0.98 3.33± 0.52 2.50± 1.64 1.50± 0.55＊＊1.33± 1.03* 0.50± 0.84＊＊0.67± 1.03＊＊1.17± 0.41＊＊0.83± 0.41＊＊0.67± 0.82＊＊中藥小劑量組Low-dose group（6）3.50± 0.84 3.83± 0.41 3.33± 0.82 2.33± 0.82 2.67± 0.82 1.00± 1.55＊＊1.33± 0.82＊＊1.50± 1.76 0.67± 0.52＊＊0.67± 0.82＊＊1.00± 0.63＊＊1.33± 0.52＊＊0.67± 0.82＊＊

2.2.2 左后肢足墊厚及跖骨最高點改善情況：與正常組比較，模型組大鼠足墊厚測量值在3周、5周、11周時升高，有統計學意義（P＜0.01）；左后肢跖骨最高點測量值在1～6周、8～12周時顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各治療組間左后肢足墊厚及左后肢跖關節腫脹程度的改善無顯著統計學意義（P＞0.05）。見表8，9。

表6 各組大鼠左后肢前后徑（mm）變化（±s，n=6）Tab.6 Changes of the anteroposterior diameters of the left hind limbs of rats in all groups（±s，n=6）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01Note.Compared with the normal group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with the model group，*P＜0.05，＊＊P＜0.01.

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周正常組Normal group 7.61± 0.63 7.23± 0.48 8.00± 0.73 8.21± 0.45 8.38± 0.64 7.47± 1.87 8.05± 0.65 8.44± 0.87 8.55± 0.29 7.68± 2.36 7.78± 0.74 7.94± 0.68 7.78± 0.78模型組Model group 10.87± 2.53 11.96± 1.23## 11.77± 1.12## 11.75± 0.67## 9.87± 3.72 10.86± 1.11 10.63± 1.01## 9.87± 1.11 10.33± 0.50## 10.60± 1.06 10.27± 1.00# 10.24± 0.88## 10.48± 0.66##陽性藥組Positive group 12.23± 1.22 12.21± 0.78 11.51± 0.78 11.16± 0.73 10.67± 0.61 10.76± 0.76 10.27± 0.90 9.72± 0.93 10.28± 0.58 9.98± 0.58 10.26± 0.67 10.31± 0.51 10.27± 0.68中藥大劑量組High-dose group 11.91± 1.16 12.45± 0.70 11.57± 0.93 10.74± 0.87 10.25± 1.21 11.17± 0.73 10.22± 0.79 10.14± 0.67 10.64± 0.83 10.35± 0.72 10.11± 0.44 10.18± 0.70 9.71± 1.02*中藥小劑量組Low-dose group 12.50± 0.98 11.93± 1.00 11.21± 1.08 10.56± 1.00 9.80± 0.90 10.69± 0.71 9.73± 0.66 9.25± 1.48 9.92± 0.93 9.72± 0.98 9.51± 0.99 9.51± 0.80 9.02± 0.63*

表7 各組大鼠左后肢左右徑（mm）變化（±s，n=6）Tab.7 Changes of the transverse diameters of the left hind limbs of rats in all groups（±s，n=6）

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周正常組Normal group 5.98± 0.33 6.60± 0.52 6.12± 0.44 6.69± 0.45 6.51± 0.30 6.89± 1.02 6.53± 0.59 6.51± 0.50 6.59± 0.46 6.64± 0.44 6.49± 0.48 6.33± 0.35 5.92± 1.40模型組Model group 8.98± 1.89 10.19± 1.13## 9.70± 0.62## 9.77± 0.68## 9.30± 0.69## 7.95± 1.18 8.91± 0.58## 8.66± 0.54## 9.34± 0.49## 8.75± 0.58## 8.66± 0.49## 8.95± 0.64## 8.61± 0.70##陽性藥組Positive group 9.51± 0.60 9.77± 0.61 9.61± 0.94 9.14± 0.58 9.28± 0.49 8.24± 1.01 8.28± 0.27 8.91± 0.46 8.32± 0.45 8.28± 0.58 8.09± 0.48 8.20± 0.49 8.10± 0.44中藥大劑量組High-dose group 9.34± 1.05 10.05± 1.05 9.28± 0.52 8.85± 0.54 8.32± 0.62 8.50± 0.33 8.27± 0.64 8.66± 0.82 8.65± 0.55 8.36± 0.61 8.38± 0.70 8.27± 0.66 7.85± 0.97中藥小劑量組Low-dose group 9.75± 0.86 10.21± 0.64 9.27± 0.89 8.59± 0.63 8.20± 0.77 8.42± 1.11 8.21± 0.49 8.58± 0.92 8.43± 0.81 7.62± 1.05 7.46± 1.03 7.98± 0.56 7.87± 0.90*

表8 各組大鼠左后肢足墊厚（mm）變化（±s，n=6）Tab.8 Changes of the Left hind limb foot pad thicknessin of the rats in all groups（±s，n=6）

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周正常組Normal group 3.74± 0.39 4.19± 0.54 4.28± 0.58 3.87± 0.29 3.97± 0.24 4.23± 0.75 3.85± 0.41 3.70± 0.37 3.63± 0.28 3.51± 0.30 3.33± 0.41 3.43± 0.42 3.67± 0.99模型組Model group 6.33± 1.57 5.81± 0.85 5.05± 0.97 5.64± 0.54## 6.72± 1.59 6.23± 1.57## 5.64± 1.51 5.31± 1.17 5.27± 1.01 5.37± 1.06 5.19± 1.19 5.02± 1.05## 4.56± 0.90陽性藥組Positive group 6.27± 0.56 6.42± 1.86 5.82± 1.69 5.60± 1.68 5.56± 1.30 5.35± 1.60 5.22± 0.77 4.72± 0.35 5.05± 0.90 4.89± 0.77 4.66± 0.75 4.33± 1.23 4.66± 0.58中藥大劑量組High-dose group 6.15± 0.49 6.10± 0.93 5.92± 1.20 5.84± 1.15 5.68± 1.23 5.54± 0.98 5.03± 0.36 5.33± 0.82 4.87± 0.54 4.45± 0.65 4.97± 0.99 4.66± 0.37 4.57± 0.80中藥小劑量組Low-dose group 6.80± 0.78 5.98± 1.45 6.10± 1.67 4.91± 0.60 5.25± 1.23 5.11± 0.87 4.88± 0.41 4.70± 0.42 5.21± 0.33 4.49± 0.86 4.58± 0.89 4.37± 0.80 4.62± 0.54

2.2.3 右后肢前后徑及左右徑變化情況：與正常組比較，模型組大鼠右后肢前后徑在0～4周、6周、8～12周時測量值顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；右后肢左右徑測量值在1～4周、6～12周時增加，有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，各治療組右后肢腫脹程度改善情況無明顯差異（P＞0.05）。見表10，11。

表9 各組大鼠左后肢跖骨最高點（mm）變化（±s，n=6）Tab.9 Changes of the highest points of left hind limb metatarsal of the rats in all groups（±s，n=6）

組別0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周Groups正常組5.36±5.92±4.94±5.36±5.56±5.64±5.81±5.54±5.67±5.26±5.58±5.46±5.41± Normal group0.380.380.730.510.480.280.520.340.360.550.360.320.47模型組8.76±9.68±9.39±8.61±8.51±9.78±8.42±7.02±8.05±8.81±8.37±8.58±8.50± Model group1.520.88##0.69##0.20##0.56##1.15##0.13##1.350.93#0.41##0.52##0.58##0.31##陽性藥組9.30±9.91±9.05±8.51±8.63±9.19±8.22±7.77±8.00±8.68±7.77±8.09±7.95± Positive group0.510.670.640.440.420.810.420.500.530.950.430.530.41中藥大劑量組8.94±9.03±8.83±7.87±8.51±8.90±8.43±8.28±8.29±8.20±8.10±8.35±8.10± High-dose group0.870.820.760.630.510.590.450.770.360.340.460.310.59中藥小劑量組9.35±9.23±8.47±8.23±8.45±8.89±8.22±8.63±8.00±8.13±8.37±7.78±7.95± Low-dose group0.580.550.700.880.310.880.330.580.260.350.370.560.61

表10 各組大鼠右后肢前后徑（mm）變化（±s，n=6）Tab.10 Changes of the anteroposterior diameters of the right hind limbs of the rats in all groups（±s，n=6）

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周正常組7.64±6.86±7.55±7.81±7.77±8.41±8.35±7.78±8.39±7.80±7.83±8.24±8.04± Normal group1.060.340.420.350.451.100.370.550.560.680.700.860.44模型組12.16±12.45±11.19±11.20±10.89±10.53±10.19±9.42±10.38±10.19±10.21±10.22±10.29± Model group1.33##1.08##1.17##0.77##0.59##1.270.65##0.990.58##1.16#0.94#0.92#0.55##陽性藥組11.71±11.58±10.40±10.73±10.57±10.38±10.00±8.71±10.12±10.21±10.24±10.05±10.15± Positive group2.012.051.651.521.501.261.160.560.710.960.761.450.61中藥大劑量組11.73±11.39±11.34±10.74±10.15±10.92±9.93±9.21±9.62±9.72±9.37±9.77±9.53± High-dose group1.391.550.330.860.600.960.770.450.830.860.630.680.76中藥小劑量組12.44±11.67±10.66±10.57±10.05±10.94±9.92±9.08±9.48±9.16±9.55±9.79±9.27± Low-dose group1.140.971.201.150.740.590.720.781.080.830.870.600.68

表11 各組大鼠右后肢左右徑（mm）變化（±s，n=6）Tab.11 Changes of the transverse diameters of the right hind limbs of the rats in all groups（±s，n=6）

組別0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 12周Groups正常組6.22±6.26±6.07±6.45±6.80±6.99±6.65±6.55±6.61±6.89±6.80±6.73±6.91± Normal group0.550.340.360.760.490.710.550.640.520.580.450.310.36模型組9.10±10.11±9.44±9.48±9.34±8.83±9.07±8.70±8.94±8.92±8.98±9.10±9.04± Model group1.900.72##0.50##0.75##0.80##0.970.49##0.73##0.55##0.72##0.55##0.93#0.82#陽性藥組9.22±9.31±8.90±8.94±8.77±8.20±8.24±8.58±8.07±8.40±8.26±8.12±8.31± Positive group1.701.841.571.091.201.400.800.801.071.130.970.920.91中藥大劑量組9.70±10.08±9.46±9.08±8.72±8.78±8.35±9.26±8.50±8.58±8.26±8.58±8.31± High-dose group0.950.950.380.450.580.950.481.300.540.440.370.390.36中藥小劑量組9.97±10.31±9.44±8.64±8.76±8.79±8.66±8.38±8.52±8.32±8.47±8.16±8.04± Low-dose group1.460.540.650.990.831.050.670.780.750.980.570.580.86

2.2.4 右后肢足墊厚及跖骨最高點改善情況：與正常組比較，模型組大鼠右后肢足墊厚測量值在0周～5周、8周、10周、11周時明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；右后肢跖骨最高點測量值在0周～6周、8周～12周時顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各治療組右后肢腫脹程度改善情況無明顯差異（P＞0.05）。見表12，13。

2.3 中藥藤莓湯對CIA模型大鼠關節滑膜IL-6、TNF-αmRNA轉錄及蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠關節滑膜IL-6、TNF-α mRNA轉錄及蛋白表達水平顯著上調（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組、中藥大、小劑量組IL-6、TNF-α mRNA轉錄及蛋白表達水平顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.01）（表14）。

表12 各組大鼠右后肢足墊厚（mm）變化（±s，n=6）Tab.12 Changes of the right hind limb foot pad thickness of the rats in all groups（±s，n=6）

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 1 2周正常組Normal group 4.05± 0.26 4.44± 0.28 3.96± 0.23 3.89± 0.22 4.01± 0.47 4.31± 0.73 3.68± 0.33 3.56± 0.28 3.47± 0.41 3.42± 0.26 3.33± 0.54 3.33± 0.47 3.46± 0.25模型組Model group 6.51± 0.81# 5.91± 0.71# 5.50± 0.72# 5.28± 0.89# 6.83± 1.16# 6.36± 1.42## 5.30± 1.17 4.50± 0.95 4.94± 0.55## 4.98± 1.08 5.04± 0.80# 4.72± 0.68## 4.49± 0.59陽性藥組Positive group 6.21± 0.83 6.22± 1.82 5.61± 1.72 5.07± 1.31 5.40± 1.24 6.18± 2.14 5.07± 1.33 4.67± 0.75 4.39± 0.86 5.23± 1.14 4.99± 0.93 4.52± 1.31 4.55± 1.10中藥大劑量組High-dose group 6.23± 0.68 6.39± 1.17 5.27± 0.68 5.11± 0.97 5.29± 0.82 6.08± 0.95 4.66± 0.48 5.13± 0.73 4.73± 0.73 4.36± 0.44 4.74± 0.54 4.45± 0.77 4.41± 0.63中藥小劑量組Low-dose group 6.82± 1.36 5.91± 1.20 5.55± 1.36 5.28± 1.48 5.33± 0.79 5.75± 0.95 4.52± 0.50 4.86± 1.16 4.49± 0.95 4.45± 0.58 4.43± 1.21 4.33± 0.65 4.84± 0.77

表13 各組大鼠右后肢跖骨最高點（mm）變化（±s，n=6）Tab.13 Changes of the right hind limb metatarsal highest point of the rats in all groups（±s，n=6）

組別Groups 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周 9周 10周 11周 1 2周正常組Normal group 5.72± 0.15 5.71± 0.24 5.24± 0.73 5.22± 0.77 5.83± 0.22 5.66± 0.37 5.72± 0.38 5.67± 0.43 5.50± 0.39 5.62± 0.42 5.67± 0.44 5.52± 0.36 5.62± 0.37模型組Model group 9.76± 0.76## 9.76± 0.84## 9.30± 0.82## 8.79± 0.22## 9.07± 0.80## 8.97± 0.59## 8.85± 0.56## 7.43± 1.63 8.23± 0.57## 8.66± 0.76## 8.25± 0.38## 9.06± 0.90## 8.46± 0.45##陽性藥組Positive group 9.09± 1.35 9.21± 1.78 8.70± 1.46 8.09± 1.45 8.59± 1.44 8.42± 1.27 7.99± 1.19 7.69± 0.87 7.39± 1.28 7.93± 1.15 7.79± 0.98 7.84± 1.18 7.95± 1.21中藥大劑量組High-dose group 9.08± 0.61 9.01± 0.53 8.76± 0.92 8.48± 0.32 8.31± 0.61 8.68± 0.60 8.11± 0.74 7.91± 1.02 8.14± 0.81 8.26± 0.59 8.04± 0.54 7.92± 0.57 8.08± 0.27中藥小劑量組Low-dose group 9.40± 0.83 9.53± 0.67 9.05± 0.35 8.64± 0.57 8.61± 0.32 8.42± 0.79 7.89± 0.51 8.53± 0.52 7.99± 0.65 8.10± 0.51 8.70± 0.54 8.25± 0.53 8.11± 0.69

表14 各組大鼠滑膜組織IL-6、TNF-αmRNA轉錄及蛋白表達水平（n=6）Tab.14 Levels of mRNA transcription and protein expression of IL-6 and TNF-α in the synovial tissue of the rats in all groups（n=6）

2.4 中藥藤莓湯對CIA模型大鼠右踝關節組織病理的影響

正常組大鼠右踝關節面光滑，軟骨細胞排列整齊，關節周圍組織未見炎性細胞浸潤。模型組大鼠右踝關節軟骨滑膜被覆上皮細胞輕度增生，關節腔縮小，周圍軟組織見輕度纖維增生，輕度炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主。藤莓湯大劑量組右踝關節滑膜增生，有少量淋巴細胞浸潤，關節軟骨纖維化，周圍軟組織有輕度纖維組織增生，較模型組無明顯差異；藤莓湯小劑量組關節周圍軟組織見少量炎性細胞浸潤，關節腔略縮小，軟骨、滑膜未見明顯病變，關節病變較模型組有所減輕（圖1，見文后彩插4）。

3 討論

RA是一種以慢性、對稱性、多滑膜關節炎及關節外病變為主要臨床表現的自身免疫性疾病。急性活動期以關節紅腫熱痛為主，中晚期可見關節腫痛，變形，功能障礙。病理特征為血管翳形成，滑膜組織肥厚，骨及軟骨破壞［3］。隨著人類對RA發病機制深入研究，治療對策及靶向性藥物不斷問世。然而，由于本病病因不明，病機復雜，病程漫長，后果嚴重，而且部分病人因肝腎功能損害或藥物過敏，嚴重影響療效［4-6］。因此，針對不同病理環節的治療方法及手段乃是國際風濕免疫學界迫切需要解決的難點。RA屬中醫學“痹證”范疇，中醫認為本病發生發展與外因風寒濕熱不同致病因素的影響，內因機體先天稟賦或后天失調有關，邪正相搏，濁毒瘀閉肢體經絡、骨節而致。RA急性活動期多以濕熱瘀毒痹阻，關節紅腫熱痛為特點［7］，當濁毒不化，交阻骨節，病深入絡，漸見關節活動不利，腫大變形的中晚期病理特征，而且瘀濁蘊久化熱成毒，作為伏邪，誘發急性發作過程，其惡性循環的病理機制導致了本病最終結局。藤莓湯為治療RA經驗方，可明顯改善RA急性期關節晨僵、灼熱腫脹、疼痛劇烈等癥狀，而且對相關炎性指標ESR、CRP及免疫指標RF、CCP有良好的糾正作用。方中忍冬藤味甘，性寒，為君，蛇莓甘苦，性寒，穿山龍、桑枝性平，味苦，為臣，四藥配伍清熱解毒，除濕通絡。乳香、沒藥、烏蛇祛瘀止痛，白芥子化痰降濁散結，諸藥共用，解熱毒、化瘀濁、通經絡、止痹痛，切中活動期RA的病理機制。為了進一步驗證該方的療效，本實驗制備了RA動物體內試驗的經典模型-CIA模型，通過上述研究，證明中藥藤莓湯能有效改善CIA模型大鼠關節滑膜病理損傷，其作用機制可能與其下調介導免疫炎性反應的核心細胞因子高表達相關。關于RA發病機制的探索，國際醫學領域經過幾代人的不懈努力，取得了突破性進展，多項研究圍繞在自身抗體和免疫復合物、T細胞介導的抗原特異性反應，T細胞獨立的細胞因子網絡，RA滑膜的腫瘤樣侵蝕性生長行為等方面展開［8］。其共識為入侵或變異的抗原激活體內免疫活性細胞，產生包括RF在內的多種多克隆抗體，激活滑膜細胞，釋放相關炎性介質，同時激活免疫復合物，激活補體系統而造成關節局部炎癥損傷。隨著認識的進一步深入，特別是T輔助細胞亞群Th17的發現，免疫-炎性反應-凋亡異常作為RA發病的核心環節被揭示。研究證明，炎性因子在RA病理改變中發揮重要作用。其中，NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-17等為介導關節滑膜免疫炎性損傷的核心因素。IL-17A是IL-17家族的原型，也是Th-17細胞主要的效應分子，在抗胞外細菌、真菌感染的宿主防御中發揮重要作用。然而，過量的Th-17細胞反應或IL-17表達則容易導致慢性炎癥和自身免疫疾病。IL-17不僅是T細胞源性促炎因子，也是炎癥反應的微調因子。已證明［9］RA患者血清、滑膜、關節滑液中IL-17高表達。IL-17單獨或與IL-1β、TNF-α聯合刺激滑膜細胞、軟骨細胞/成骨細胞及單核巨噬細胞分泌多種促炎因子，并與其發揮協同效應，放大靶器官免疫反應及炎癥性破壞［10］。而且能誘導滑膜細胞、多形細胞產生金屬蛋白酶，抑制軟骨基質形成，刺激破骨細胞增生，介導骨質破壞。IL-6是由T淋巴細胞、單核細胞和成纖維細胞產生，在調節免疫應答，促進骨髓造血等方面均有重要作用。IL-6作為炎性介質對 RA致病作用主要在于增加 IL-1、TNF-α效應，是TNF-α的某些生物學效應的放大因子。IL-6具有前炎癥功能，促進RA產生自身抗體及促進骨吸收的作用，參與RA的骨破壞及局部骨侵蝕。IL-6是第一個被認識的IL-17的靶基因，同時作為Th-17細胞分化過程中的必須因子正反饋調節IL-17的產生及功能［11，12］，同時，IL-17又通過誘導IL-6維持Th-17細胞數量，以正反饋形式維持一種慢性炎癥狀態［13］。TNF-α參與RA多種致病機制，TNF-α誘導內皮細胞表達粘附分子，促進白細胞與血管內皮細胞進行粘附滲透引起局部炎癥。通過NF-κB途徑誘導纖溶酶原激活物、血管內皮生長因子等，促進滑膜的炎癥和血管翳生成及發展，以及浸入滑膜下組織，促進軟骨細胞及成纖維細胞分泌地諾前列酮，促進膠原降解及軟骨損害［14］。由此可知，炎性因子參與RA的發病及病理損傷過程。炎性因子相互作用，相互促進，級聯反應形成一個復雜的網絡鏈，持續性、進行性損傷關節滑膜，乃至殘損性骨破壞。本實驗同時檢測了NF-κB、P53等相關信號分子（相關文章在發表中），結果與文獻報道相符［8，15］，證明CIA模型成模12周內，能更確切的反映出活動期RA的病理特征及其機制。可能為豐富RA靶向治療提供有價值的參考。

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Effects of the Chinese herbal compound，Tengmei decoction，on inflammatory injury in joints of rat models of typeⅡcollagen-induced arthritis

LU Yan1，WANG Ya-nan1，LIU Hui1，MA Wei-guo1，ZHANG Ji-sheng1，TAN Ling2，LI Hui-hui3，LIN Zi-chao1，SHEN Zhi-ming1，WANG Jie1，MENG Feng-xian1
（1.Department of Rheumatology，Dongfang Hospital，the Second Clinical Medical College of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China；2.Department of Encephalopathy，Integrative Medicine Hospital in Changping District，Beijing 102208；3.Department of Rheumatology，Traditional Chinese Medicine Hospital in Miyun County，Beijing 101500）

Objective To explore the effects of Chinese herbal compound，Tengmei decoction，on type IIcollagen-induced arthritis（CIA）in rats，and to examine the changes of arthritis index（AI），limb swelling，joint tissue inflammatory infiltration，and the effects on immune-inflammatory factors.Methods Sprague-Dawley rat models of arthritis were successfully established by intradermal injection of type II collagen and Freund’s complete adjuvant.The model rats were randomly divided into model group，positive drug group，and high-and low-dose Chinese medicine groups，6 rats in each group.The intervention and treatment period was 12 weeks.To measure weekly the anteroposterior and transverse diameters of the rear ankles and wrists，the transverse diameter of the claw foot palm pad，the thickness and the highest point width of hind limb plantar joint swelling，and to evaluate the integrated scores of joints and limbs swelling using a vernier caliper.Results ①Compared with the normal group，the total arthritis scores and hind limbs AI scores of the model group were significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）.The left forelimb AI scores were significantly increased during 10-12 weeks（P＜0.05）.The anteroposterior and transverse diameters of the left hind limb，the thickness of the highest point measurement of the left hind foot pad metatarsal were significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）in different time periods between 1-12 weeks.Compared with the model group，the total scores and the left hind limb joints AI scores of the high-and low-dose drug groups were decreased after 6 weeks（P＜0.05）.② Compared with the normal control group，levels of mRNA transcription and protein expression of IL-6 and TNF-α were significantly upregulated（P＜0.01）in the model group.Compared with the model group，the levels of mRNA transcription and the expression of IL-6 and TNF-α proteins were significantly down-regulated in the positive group and Chinese medicine groups（P＜0.01）.③ Histological examination showed that the low-dose TCM significantly improved the CIA synovial hyperplasia and inflammatory cell infiltration.Conclusions The molecular mechanism of Chinese herbal compound Tengmei decotion in improving joint pathological injury of CIA rat models may be related to its inhibitory effect on the high expression of immune-inflammatory factors in the synovial tissue of CIA rats.

Chinese herbal compound，Tengmei decoction；Rat models；Arthritis，collagen II-induced；Arthritis index，AI；Pathological changes；Immune-inflammatory mechanism

R33

1671-7856（2015）04-0048-10

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.010

陸妍（1986-），女，研究方向：風濕免疫及代謝性疾病的臨床治療及機制研究。E-mail：tracyloo@163.com。

孟鳳仙（1955-），女，研究方向：風濕免疫及代謝性疾病的臨床治療及機制研究。Emai：mfx0823@163.com。

2015-02-03