蕨麻小型豬與巴馬小型豬高原多臟器功能障礙綜合征模型的比較研究

牛廷獻，郭曉宇，申 健，王紅義，陸 璐，肖 攀，馮小明

（蘭州軍區蘭州總醫院，蘭州 730050）

蕨麻小型豬與巴馬小型豬高原多臟器功能障礙綜合征模型的比較研究

牛廷獻，郭曉宇，申 健，王紅義，陸 璐，肖 攀，馮小明

（蘭州軍區蘭州總醫院，蘭州 730050）

目的 比較不同海拔地區兩種小型豬高原多臟器功能障礙綜合征（H-MODS）模型存在的差異，探討建立H-MODS模型的理想動物。方法 利用高原土生蕨麻小型豬與平原巴馬小型豬，以內毒素（LPS）建立HMODS模型。檢測不同時點血液生理生化指標的變化，并觀察肺臟組織病理學變化。結果 巴馬小型豬模型的死亡率明顯高于蕨麻小型豬；生理生化各指標的變化基本相同，但蕨麻小型豬的變化較平緩。在24 h與48 h肺臟均出現嚴重病理改變，但巴馬小型豬較蕨麻小型豬更嚴重。結論 不同海拔地區的兩種小型豬均可成功建立HMODS模型，同時蕨麻小型豬由于自身高原生物特性對H-MODS模型的復制更加準確安全，避免高原環境的外在因素的影響。

高原多臟器功能障礙綜合征模型；蕨麻小型豬；巴馬小型豬；比較

我國高原地區急性重型高原病并發多臟器功能障礙綜合征（multiorgan dysfunction syndrome，MODS）的發病率較高［1，2］。高原地區發生 MODS（H-MODS）后雖然在本質上與平原MODS沒有差別，但從平原進駐高原后隨著海拔高度的上升，以缺氧的環境因素逐漸成為主要影響因素。從而不同程度地改變了MODS的發病過程、臨床特征和預后，使其治療方案也隨之發生了顯著變化［3］。而HMODS在治療中的不確定因素比平原地區更多、變數更大，使得難以全面細致觀察H-MODS患者病情變化的全過程。H-MODS動物模型是研究其發病機制和臨床防治的基礎，但目前研究所使用的實驗動物均為低海拔或中度海拔生長培育的［4-7］，不具有高原生物學特性。在建立高原疾病模型時，不同海拔地區的動物對所建模型的質量是否存在差異未見報道。而在研究中低海拔地區生長的實驗動物自身會出現不同程度的高原反應，受高原環境的外在因素的影響很大，這就難免使得實驗結果出現一些誤差。對此，本研究采用高原蕨麻小型豬和巴馬小型豬建立H-MODS模型，以研究二者對模型質量存在的差異，尋求建立H-MODS模型理想的實驗動物。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

蕨麻小型豬與巴馬小型豬各6只，雌雄各半，體重15 kg左右，分為蕨麻小型豬（JM）組和巴馬小型豬（BM）組。蕨麻小型豬為蘭州軍區總醫院動物實驗科培育，巴馬小型豬購自第四軍醫大學動物實驗中心（生產許可證：SCXK（軍）2012-006）。氯胺酮（國藥準字：H35020148，福建古田藥業有限公司），地西泮注射液（國藥準字：H12020957，天津金耀氨基酸有限公司），LPS（血清型為：O127：B8，批號為64H4010，美國Sigma公司）。生化分析儀：Beckman公司，Coulter LX20。

1.2 模型建立

制模方法參照文獻［4，8］，本實驗在海拔3500 m的甘南桑科草原進行，將豬運輸到目的地之后，休整3 d待動物的狀態穩定之后再進行實驗。JM和BM均采用氯胺酮（6 mg/kg）聯合安定（0.5 mg/kg）進行肌內注射麻醉，同時肌內注射阿托品（0.05 mg/kg）。兩組豬麻醉后經耳靜脈泵入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（0.35 mg/kg，30 min內泵完）。

1.3 血常規和血清生化指標的測定

血常規及各項生化指標的檢測均由本院檢驗科完成。分別于0、3、6、12、24、48和72 h經頸靜脈采血，測定血液血常規：紅細胞計數（RBC）、白細胞計數（WBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞積壓（HCT）、紅細胞平均體積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白含量（MCH）、血小板（PLT）等和血清生化指標：肌酸激酶（CK）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）和肌酐（CRE）。

1.4MODS的診斷標準

參照胡森等［8，9］提出的動物發生MODS時各個器官功能障礙分期診斷標準和評分標準。在注射LPS后出現2個或2個以上器官或系統功能障礙判定為MODS。1.5 統計學方法

2 結果

2.1 體征表現

JM組豬麻醉后由耳靜脈泵入LPS，30 min內輸完，1 h后JM豬開始轉醒但是倒臥不起，呼吸及心率增快，并出現腹脹、發熱、尿頻；蘇醒后四肢無力倒臥，無食欲，精神萎靡，呼吸急促；8～10 h后JM組豬站立行走，開始采食，精神狀態良好，基本恢復正常；其中1頭JM組豬在4 h因呼吸窘迫、心律、繼之心衰死亡。BM組豬的體征表現與JM組相比出同樣癥狀但更嚴重；BM組豬麻醉并在30 min內輸完LPS，1 h后還處于昏迷狀態，2 h后開始轉醒但倒臥不起，呼吸及心率增快，并出現腹脹、發熱、尿頻，無食欲，精神萎靡；5 h與14 h分別有1只豬出現死亡；12～16 h后JM組豬站立行走，開始采食，精神狀態良好，基本恢復正常。JM組與BM組豬死亡率分別為16.7％和33.3％。

2.2 生化水平比較

蕨麻小型豬與巴馬小型豬生化水平比較結果見圖1。其CK、AST變化趨勢兩者是相同的，0 h～6 h急劇上升，12 h～24 h達到最大，之后又開始下降至72 h基本恢復正常，兩者的表達水平也是非常的相近（見圖1-1，1-2）。JM組ALT在48h后略呈下降趨勢，BM組變化趨與水平（見圖1-3）；BM組TBIL水平在0h高于JM組并一直上升，24 h達到最大，24～48 h急劇下降；JM組水平低于BM組，0 h～12 h其變化基本趨于水平，12 h～48 h與BM組相同具有先升高后降低的趨勢，但是變化幅度很小（見圖1-4）。BM組CRE水平高于JM組，且在0 h～3 h略有降低，在3 h～12 h開始上升，之后緩慢降低；JM組水平變化平緩并趨于水平（見圖1-5）。

2.3 血常規水平比較

蕨麻小型豬與巴馬小型豬血常規水平比較結果見圖2。兩者WBC、RBC、PLT變化趨勢是相同的，WBC在0 h～3h急劇下降，6 h～24h急劇上升，24 h～72h又開始下降（見圖2-1）；RBC在0 h～3 h基本沒有變化，在3 h～6h上升，6 h～24 h下降，24 h～72 h又開始上升（見圖2-2）；PLT水平變化趨勢是先下降后升高（見圖2-3）。盡管兩者WBC、RBC、PLT變化趨勢是相同，但是JM組變化幅度較BM組相對平緩，此外WBC與RBC水平JM組在0 h要高于BM組，但是0 h PLT水平BM組高于JM組。其余血常規指標兩者之間沒有明顯的區別。

2.4 肺組織病理變化比較

圖1 蕨麻小型豬與巴馬小型豬生化指標變化比較Fig.1 Changes of biochemistry in the Juema minipig and Bama minipig.

圖2 蕨麻小型豬與巴馬小型豬生化指標變化比較Fig.2 Changes of blood WBC，RBC and PLT in the Juema minipig and Bama minipig.

巴馬小型豬與蕨麻小型豬24 h（A、B）、48 h（C、D）及正常對照（E、F）肺組織病理切片如圖3所示。A肺泡腔無滲出，均勻一致，支氣管腔完整，肺泡上皮細胞排列整齊，毛細血管擴張充血，有少量紅細胞滲出；B肺泡結構基本完整，毛細血管無擴張，無水腫，無紅細胞擁堵現象，肺泡間隔增寬，部分肺泡上皮細胞排列雜亂。C肺泡腔內彌散性淤血，有大量紅細胞滲出及少量中性粒細胞浸潤，巨噬細胞增多，肺泡間隔增寬，毛細血管擴張充血；D肺泡腔內有輕微出血，肺泡壁模糊，有少量紅細胞滲出，肺泡間隔略有增厚。E和F肺組織結構未見異常改變（圖3封二）。

3 討論

高原蕨麻小型豬生長于我國青藏高原甘南藏族自治州合作地區。由于生存在惡劣高寒氣候和低劣的飼養條件下，使其具有適應高原環境的獨特的生物學特性。并且長期以來在封閉環境中自繁自養免受外來血緣的雜交影響，從而它形成了一個穩定的原始的地方小型豬種。它生長緩慢、體形矮小、繁殖能力強，是典型的高原小型豬種之一［10］。在高原地區，伴隨著海拔的增高，低氧、低壓環境等影響因素也在加強，促使MODS發生發展也急驟加快，因而選擇合適的動物建立模型，可以更準確的了解高海拔地區MODS的演變規律，病理變化特點，對高海拔地區MODS早期診斷、早期治療提供重要的參考依據。本研究采用高原土生蕨麻小型豬和巴馬小型豬建立H-MODS模型進行對比分析，研究高原醫學與實驗動物的高原特性之間關系。

在MODS的研究中，采用大小鼠、兔及大型動物如綿羊和犬等均可用于建立MODS模型［11-13］，大、小鼠對內毒素敏感性較差，解剖結構與人差別較大，不是理想的模型動物；兔雖然對內毒素敏感性好，但死亡率很高；而小型豬在疾病發病機理、生理學、解剖學等方面與人相似度很高，從而成為研究人類疾病理想的實驗動物［14-18］，利用小型豬建立MODS模型能夠更加真實地模擬病理變化和臨床特征。

本研究選擇具有高原特性的蕨麻小型豬與巴馬小型豬在相同條件下建立高原MODS動物模型，兩者均可以在小劑量LPS作用下就能形成全身性炎癥反應（SIRS），繼而誘發MODS［19］。兩者建模后CK、AST變化趨勢兩者是相同的，先急劇增高然后再下降至72h基本恢復正常，兩者 ALT、TBIL及CRE變化基本相同，并且兩者的表達水平也是非常的相近，但是TBIL和CRE的變化趨勢蕨麻豬較小型豬平緩一點。WBC在0～3 h急劇下降，6 h～24h急劇上升，24 h～72 h又開始下降，與綿羊高原MODS模型的變化規律完全吻合［20］，雖然兩者WBC、RBC、PLT變化趨勢相同，但是JM組變化幅度較BM組相對平緩。

研究發現，內毒素繼發的全身炎癥在高海拔地區反應明顯比低海拔地區嚴重，同時高原地區MODS所引起的死亡率［21］、肺部損傷病理改變也比亞高原地區明顯嚴重［5］。本研究采用平原動物與高原地區動物分別建立高原MODS模型都引起嚴重的肺部損傷，在48 h肺部病理變化最為嚴重，肺臟均出現不同程度的充血水腫，肺泡腔內淤血，紅細胞滲出，肺泡間隔略有增厚等明顯的病理特征，但是蕨麻小型豬的病理變化較巴馬小型豬略微小，而且兩組死亡率蕨麻小型豬明顯低于巴馬小型豬。這可能與高原MODS中性粒細胞在低氧環境暴露下功能改變密切相關，研究發現在急性缺氧環境下中性粒細胞趨化能力加劇，體現在常氧對照組中性粒細胞偽足長度小于急慢性缺氧組［22］。同時，在高海拔地區，由于低氧應激因素的存在，MODS模型表現出病理損傷較中度海拔地區嚴重，然而在主要的損傷器官中，肺損傷尤其明顯，可能是在LPS誘導的MODS發生發展中，伴隨著早期炎癥介質大量釋放而引起肺泡毛細管膜過渡炎癥反應。有研究報道，在相同內毒素劑量誘導下，高海拔地區建立動物模型時所引起機體的病理損傷比中度海拔地區嚴重，這就反應了外在的低氧環境可能會推動病情的發展［5］。

因此，在建立高原疾病模型實驗動物的選擇中，由于不同的實驗動物具有不同的生物學特性，對于高原低氧環境的適應能力不同，所以在建立疾病模型時，非高原性實驗動物受高原低氧環境的影響更大。這也就提示在高原疾病的研究中選用高原特性實驗動物將更準確的模擬疾病發生發展特點的同時可避免外在的打擊因素而引起的死亡。

［1］周其全，劉福玉，鄭必海，等.3184例重型急性高原病患者并發多器官功能障礙綜合征的結果分析［J］.中國危重病急救醫學，2007，19（1）：362-401.

［2］周其全，劉福玉，鄭必海，等.白細胞與白細胞介素增高在急性高原病并發多器官功能障礙中的作用及臨床意義［J］.中國危重病急救醫學，2007，19（10）：5882-5921.

［3］張世范，劉毅，高煒，等.高海拔地區多臟器功能障礙評分系統診斷的標準［J］.中華急診醫學雜志.2006，15（4）：366-369.

［4］牛廷獻，萬東君，陸璐，等.高原地區多臟器功能障礙綜合癥綿羊模型的建立［J］.實驗動物與比較醫學，2012，32（4）：285-289.

［5］萬東君，牛廷獻，王春雨，等.高海拔地區內毒素致綿羊多臟器功能障礙綜合征的病理學改變［J］.中國比較醫學雜志，2012，22（8）：40-43.

［6］王紅義，馮小明，史智勇，等.亞高原與高原地區綿羊多臟器功能障礙綜合征血清生化指標的比較［J］.中國比較醫學雜志，2012，22（7）：56-59.

［7］牛廷獻，萬東君，羅曉紅，等.血必凈對高原綿羊多臟器功能障礙綜合征的治療研究［J］.中華老年多器官疾病雜志，2013，12（8）：625-628.

［8］胡森，盛志勇，周寶桐，等.雙相遲發多器官功能不全綜合征（MODS）動物模型的研究［J］.中華創傷雜志，1996，12（2）：102-106.

［9］胡森，盛志勇，周寶桐.MODS動物模型研究進展［J］.中國危重病急救醫學，1999，11（8）：504-507.

［10］景致忠，張永興，王自強，等.甘肅蕨麻豬實驗動物化應用前景［J］.實驗動物科學與管理，1997，14（4）：64-65.

［11］段紹斌，李學雄，姚華，等.多器官功能障礙綜合征時血管內皮細胞損傷的研究［J］.新疆醫科大學學報，2010，33（3）：271-274.

［12］盧瑗瑗，尹文，虎曉岷.家兔失血性休克并內毒素誘發多器官功能障礙綜合征模型制備［J］.江蘇醫藥，2005，31（6）：448-450.

［13］任添華，牛馳，任愛民，等.動物模型組織氧代謝的變化特征［J］.首都醫科大學學報，2008，29（3）：308-310.

［14］Wei HJ，Qing YB，Pan WR，et al.Comparison of the efficiency of Banna miniature inbred pig somatic cell nuclear transfer among different donor cells［J］.Plos ONE，2013，8（2）：57728.

［15］Kim YK，Lee GS，Jung EM，et al.Generation of fibroblasts overexpressing liver-specific PEPCK in a miniature pig model of human type 2 diabetes mellitus［J］.Mol Med Report，2012，6（1）：45-50.

［16］Christoffersen B，Golozoubova V，Pacini G，et al.The young Gottingen minipig as a model of childhood and adolescent obesity：influence of diet and gender［J］.Obesity，2013，21（1）：149-158.

［17］馮書堂.我國小型豬資源實驗化培育及開發利用［J］.實驗動物科學，2007，24（6）：111-118.

［18］袁進，顧為望.小型豬作為人類疾病動物模型在生物醫學研究中的應用［J］.動物醫學進展，2011，32（2）：108-111.

［19］胡森，盛志勇，周寶桐.MODS動物模型研究進展［J］.中國危重病急救醫學，1999，11（8）：504-507.

［20］牛廷獻，萬東君，陸璐，等.高原地區多臟器功能障礙綜合癥綿羊模型的建立［J］.實驗動物與比較醫學，2012，32（4）：285-289.

［21］王紅義，馮小明，史智勇，等.亞高原與高原地區綿羊多臟器功能障礙綜合征血清生化指標的比較［J］.中國比較醫學雜志，2012，22（7）：56-59.

［22］周其全，張世范.中性粒細胞過渡激活在急性高原病伴多臟器功能障礙中的作用及其機制［J］.臨床軍醫雜志，2009，37（2）：308-311.

Comparison of the Bama minipig and Juema minipig models of high altitude multi-organ dysfunction syndrome

NIU Ting-xian，GUO Xiao-yu，SHEN Jian，WANG Hong-yi，LU Lu，XIAO Pan，FENG Xiao-ming
（Department of Animal Experiment，Lanzhou General Hospital of PLA Lanzhou Military Command，Lanzhou 730050，China）

Objective To compare the Bama minipig and Juema minipig models of high altitude multi-organ dysfunction syndrome.Methods Six plateau-origin Juema minipigs and plain-origin Bama minpigs in each group

intravenous infusion of 0.35 mg/kg lipopolysaccharide（LPS），respectively.Blood samples were taken at 0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after LPS infusion.Routine blood test was performed，blood CK，AST，ALT，TBIL，CRE were assayed，and histopathological examination of the lung tissues was performed at 24 h，48 h after LPS infusion.Results The mortality of Bama minipigs was 33.3％，higher than that of 16.7％of Juema minipigs.The trend of physiological and biochemical changes was similar，but was milder in the Juema minipigs than in Bama minipigs.The lung injuries of the Bama minipigs at 24 h and 48 h were more severe than those in the Juema minipigs.Conclusions Both Bama and Juema minipig models of high altitude multi-organ dysfunction syndrome can be successfully established.Juema minipig models can be more closely and safely established，due to its own plateau biological properties，and avoid the influence by extrinsicinjurious effects of plateau environment.

High altitude multi-organ dysfunction syndrome；Juema minipig；Bama minipig；Animal model

R33

A

1671-7856（2015）04-0033-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.007

甘肅省技術研究與開發專項計劃（1205TCYA010）。

牛廷獻（1966-），男，主任技師，主要研究方向：人類疾病動物模型的建立及相關研究。E-mail：niutx10000@163.com。

馮小明（1980-），男，主管技師，主要研究方向：實驗動物質量控制及開發研究。Email：fxm8006@163.com。

2015-02-09